Topirea ADN-ului. Proprietățile fizico-chimice ale ADN-ului ADN relaxat și supraînrulat

Proprietățile fizico-chimice ale ADN-ului

Numele parametrului	Sens
Subiect articol:	Proprietățile fizico-chimice ale ADN-ului
Rubrica (categoria tematica)	Sport

1. Denaturarea

Denaturarea ADN-ului are loc sub influența factorilor chimici (uree, clorură de guanidină, acid, alcali) și a factorilor fizici (temperatură). Ca urmare a denaturarii, structura secundara a ADN-ului este distrusa. Când influența factorului de denaturare este îndepărtată, structura secundară a ADN-ului trebuie restabilită. Acest proces se numește renaturare˸

Denaturarea sau topirea ADN-ului este însoțită de o creștere a densității optice a soluțiilor de ADN la o lungime de undă de 260 nm. Acest fenomen se numește efect hipercromic. Creșterea maximă a densității optice a unei soluții de ADN la descompunerea sa completă în mononucleotide la lungimea de undă indicată este de aproximativ 80%.

O moleculă de ADN constând numai din poli-d(AT) se topește la temperaturi mai scăzute decât o moleculă de ADN constând din poli-d(GC). Acest lucru se datorează faptului că între A și T se formează două legături de hidrogen, iar între G și C se formează trei legături de hidrogen.

2. Punct de topire

Cea mai importantă caracteristică a ADN-ului este temperatura sa de topire, care corespunde temperaturii la care creșterea densității optice a unei soluții de ADN este egală cu jumătate din creșterea sa maximă observată în timpul denaturarii complete a ADN-ului. Punctul de topire al ADN-ului format din poli-d(AT) este de 66 o C, ADN-ul format din poli-d(GC) este de 85 o C. ADN-ul natural are un punct de topire mai mare de 66 o C, dar mai mic de 85 o C. C, deoarece conțin toate cele patru baze azotate, dar în proporții diferite în diferite organisme vii. Astfel, ADN-ul uman este caracterizat printr-un punct de topire de 81 - 82 o C, E. coli - 90,5 o C.

Când soluția de ADN este răcită (recoace), structura secundară inițială a ADN-ului poate fi restaurată în conformitate cu principiul complementarității.

3. Hibridarea

Dacă un amestec de diferite molecule de ADN este inițial topit și apoi recoapt, atunci dacă există asemănări în structurile lor primare, hibridizarea între moleculele de ADN este posibilă.

Figura - Hibridarea între diferite molecule de ADN

Cu cât este mai mare asemănarea dintre moleculele de ADN, cu atât este mai mare gradul de hibridizare. Pe baza rezultatelor hibridizării dintre ADN-ul diferitelor specii de organisme vii, se poate judeca relația lor. Cu cât gradul de hibridizare este mai mare, cu atât relația dintre speciile analizate este mai strânsă.

Hibridizarea este de asemenea posibilă între moleculele de ADN și ARN, cu condiția ca secvențe de nucleotide omoloage să fie prezente.

Figura - Hibridarea dintre ADN și ARN

4. Acizii nucleici absorb puternic lumina ultravioletă, iar această proprietate stă la baza determinării concentrației lor. Efectul mutagen al luminii ultraviolete este, de asemenea, asociat cu această proprietate.

Organizarea ADN-ului eucariotelor

Lungimea moleculei de ADN a eucariotelor este de multe ori mai mare decât dimensiunea celulei. Trebuie să fie ambalat corespunzător pentru a permite desfășurarea diferitelor procese biologice. Există mai multe niveluri de compactare a acestuia.

1. ADN gol – este o spirală dublă, diametrul său este de 1,8 nm˸

Un astfel de ADN este hipersensibil la DNazele, enzimele care hidrolizează legăturile fosfodiester.

Proprietățile fizico-chimice ale ADN-ului - concept și tipuri. Clasificarea și caracteristicile categoriei „Proprietăți fizico-chimice ale ADN-ului” 2015, 2017-2018.

Structura ADN-ului
Se formează ADN
Compoziția nucleotidelor ADN
Topirea ADN-ului
Topologia ADN-ului
ADN-ul este o moleculă formată din două molecule antiparalele legate prin legături de hidrogen conform principiului complementarității pentru a forma o structură elicoidală.

Structura ADN-ului

Unitatea structurală a lanțului ADN este o dezoxiribonucleozidă, constând dintr-un fosfat, un zahăr dezoxiriboză și patru nucleotide: adenină (A), citozină (C), guanină (G) și timină (T). La unii fagi, timina este înlocuită cu uracil (fagul PBS1), care de obicei face parte din ARN. Nucleotidele a două lanțuri de ADN sunt legate prin legături de hidrogen după principiul complementarității: A-T, G-C.purine (2 inele) -Adenină, Guanină pirimidine -Timină, Citozină |
d ADN=20A; - pentru purina-12A, pentru pirimidină-8A |
Există 2 legături H în perechea A-T și 3 în perechea G-C |
Moleculă de ADN rotativă
Tautomerie de bază
În heterocicluri, protonii asociați cu azotul se pot transfera
pe alți atomi de azot sau pe atomii de oxigen ai grupării ceto și în soluții va exista un echilibru al diferitelor structuri tautomerice care se transformă rapid unele în altele.
Ca urmare a transformărilor tautomerice, U și G sub formă de enol, atunci când sunt împerecheate, pot imita C și A, iar C și A în formă imino pot imita U și G, ceea ce poate duce la mutații în ADN (Fig.).
Staking interacțiune
Bazele din lanțul ADN se află una peste alta într-o stivă, ceea ce asigură o stabilizare suplimentară a interacțiunii lanț - stivuire.
Mărimea interacțiunii de stivuire între baze: purină-purină>pirimidină-purină>pirimidină-pirimidină
În oligo- și polinucleotide, stivuirea între bazele adiacente duce la formarea unei structuri elicoidale monocatenare stabile (poliA), iar absența stivuirii duce la o bobină dezordonată (poliU)
Energia interacțiunilor de stivuire ~ -3 - -15 kcal/mol
Coloana vertebrală a fosfatului de zahăr din afara bazei din interiorul fosfaților dezoxiroboze este conectată prin legături fosfodiester. Grupările OH ale fosfatului sunt conectate
cu gruparea OH pe carbonii de 3" și 5" ai dezoxiribozei.
Împerecherea greșită poate apărea atunci când timina este în formă enol sau citozina este în formă imino.

Modificări ale nucleotidelor

Fig.1 Nucleotide modificate[Cântăreaţă].

Nucleotidele din ADN pot suferi modificări: 5-metilcitozină,
5-hidroximetilcitozină, 5-hidroximetiluracil,
N-metiladenină. În ADN-ul unor bacteriofagi, mono- sau dizaharidele sunt atașate de gruparea hidroximetil a hidroximetilcitozinei folosind o legătură glicozidică. ADN-ul majorității eucariotelor și nevertebratelor inferioare conține relativ puțină 5-metilcitozină și
N6-metiladenină. La vertebrate, metilarea bazei joacă un rol
rol important în reglarea expresiei genelor, 5-metilcitozina fiind cea mai comună. Arătat, că
Mai mult de 95% din grupările metil din ADN-ul vertebratelor sunt conținute în resturile de citozină ale dinucleotidelor CG rare și mai mult de 50% dintre aceste dinucleotide sunt metilate. La plante, 5-metilcitozina poate fi găsită în dinucleotidele CG
și trinucleotide CNG (N – C, A sau T).

Formele ADN-ului

Opțiuni	Forma B	O forma	în formă de C	în formă de Z
spirală	dreptaci	dreptaci	dreptaci	stângaci
unitati repeta	1 luni	1 lun	1 lun	2 luni
Luni în circulație	10,4	10,7	9.3	12
diametru	23.7A	25,5A		18.4A
rotatie/lun	35,9	33,6	38,7	60/2
înclinarea lui mon către axă	-1,2	+19		-9
rast. m-y mon de-a lungul axei	0,332 nm	0,23 nm		0,38 nm
lungimea spiralei	34A	28A	31A	34.4A

La studierea ADN-ului folosind diverse metode, s-a descoperit că există diferite forme de ADN formate în diferite condiții (concentrații de sare, umiditate), dintre care unele sunt capabile să existe în organismele vii.

Există familii A, B, C, D, T de forme de ADN, care pot fi împărțite în diferite subtipuri (C", C"").
B-ADN- starea fundamentală a ADN-ului prezentată în cristale și în soluții apoase.
C-ADN- forma existenta la concentratie mica de Na si umiditate 44-66%, daca GC=31-72%.
A-ADN- această formă se formează în hibrizii ADN-ARN, prin urmare, în timpul transcripției, ADN-ul trece în forma A, la locul contactului ARN-pol. Această formă se caracterizează prin prezența unui gol intern cu un diametru de 5A.

Z-ADN- forma stângă Tranziția B-->Z este facilitată de prezența secvenței GC-5", care este locul de metilare în organisme. Astfel de secvențe din plasmide, în timpul supraînfăşurării, trec de la forma B la forma Z.
La tranziția B-->Z, regiunea de 11 pb are o formă de tranziție între helixul stâng și cel drept.
Z-ADN a fost găsit în interbenzile cromozomilor politenilor D. melanogaster.

Polinucleotida GC-5", fiind în forma B la concentrații scăzute de sare, formează nucleozomi. La concentrații mari de sare, polinucleotida GC-5" intră în forma Z, care nu formează nucleozomi.
Formele A-, Z- nu pot exista într-o soluție apoasă fără influențe suplimentare (proteine, supraînfăşurare).

D-ADN- regiuni bogate în AT ale ADN-ului fagului T2, în care citozina este înlocuită cu 5"-hidroximetilcitozină, singurul ADN natural cunoscut este în forma D. În plus, ADN-ul fagului este glicozilat cu mai mult de 70%.
Helixul dublu al ADN-ului D este răsucit mai strâns decât ADN-ul B și are o canelură minoră adâncă - o cavitate convenabilă pentru a găzdui apă și cationi.

Structuri ADN 3D

îndoirea ADN-ului

Compoziția nucleotidică a ADN-ului

Regulile Chargaf
Compoziția nucleotidică a ADN-ului unora
organisme[Cântăreaţă].

Sursă	A	G	C	T	A+T/G+C	A+G/T+C	G+C, mol.%
Bacteriofagul λ Bacteriofagul T2 Escherichia coli Bacillus subtilis Papilomavirusul lui Shope Saccharomyces cerevisiae Chlamydomonas gagică Mouse Vacă Grâu	26,0 32,5 23,8 29,0 26,6 31,3 19,6 27,9 28,9 27,3 27,2	23,8 18,2 26,0 20,7 24,5 18,7 30,2 21,2 21,1 22,5 22,6	24,3 16,72 26,4 21,3 24,2 17,1 30,0 21,5 20,3 22,5 22,8	25,8 32,6 23,8 29,0 24,7 32,9 19,7 29,4 30,0 27,7 27,4	1,08 1,86 0,91 1,38 1,05 1,79 0,65** 1,34** 1,44** 1,22** 1,20**	0,99 1,03* 0,99 0,99 1,04 1,00 0,99** 0,96** 1,00** 0,99** 0,99**	48 35* 52 42 49 36 60** 43** 41** 44** 45**

* 5-hidroximetilcitozină
** inclusiv 5-metilcitozină

La eucariote, frecvența de apariție a 5"-CG-3" este mai mare decât 5"-GC-3", deoarece dinucleotida 5"-GC-3" suferă metilare, care este implicată în reglarea expresiei genelor. La procariote, raportul 5"-CG-3"/5"-GC-3" este aproape de aleatoriu (vezi tabel).

Dimensiunea moleculei de ADN

Mărimea ADN-ului este exprimată în perechi de nucleotide (pb) sau în mii de perechi de nucleotide (tbp)

Sursă	M, da	Lungime	Lun	Tipul structurii
Bacteriofag φХ174 SV40 Bacteriofagul T2 Cromozomul Hemophilus influenzas Cromozomul Escherichia coli Saccharomyces cerevisiae Cromozomul 1 Cromozomul 12 Drosophila melanogaster Cromozomul 2 Cromozomul 3 Cromozomul 4	1,6 10 6 3,5 10 6 1,2 10 8 7,9 10 8 2,6 10 8 1,4 10 8 1,5 10 9 4 10 10 4,2 10 10 4 10 9	1,6 µm 1,1 µm 50 µm 300 µm 1 mm 50 µm 500 µm 15 mm 16 mm 1,5 mm	5 10 3 5,2 10 3 2 10 5 1,2 10 6 4 10 6 2,1 10 5 2,2 10 6 6,0 10 7 6,3 10 7 6 10 6	Inel unic Inel dublu catenar Linear dublu catenar Necunoscut Inel dublu catenar Linear dublu catenar Linear dublu catenar Linear dublu catenar Linear dublu catenar Linear dublu catenar

Topirea ADN-ului

Denaturarea sau topire- divergența lanțurilor de ADN atunci când ADN-ul este încălzit la ~1000C sau când pH-ul crește.
Divergența lanțului apare din cauza distrugerii legăturilor slabe de hidrogen
conexiuni și interacțiuni plane între baze.
Denaturarea este influențată și de: ionii metalelor mono și divalente, proteine ​​care neutralizează sarcinile negative ale grupărilor fosfat.
Punctul de topire al GC este mai mare decât AT. Pentru a rupe două legături H ale perechilor AT, este necesară mai puțină energie decât pentru a rupe trei legături H ale perechilor GC; valorile de temperatură și pH la care are loc denaturarea depind de compoziția nucleotidică a ADN-ului.
Curba de topire a ADN-ului
Denaturarea este un proces reversibil; restaurarea ulterioară a structurii ADN-ului dublu catenar poate avea loc chiar și cu divergența completă a lanțurilor. Procesul de reunificare, numit renaturare, reasociere sau recoacere, are loc atunci când
scăderea temperaturii sau a pH-ului
Cu o scădere bruscă a temperaturii sau pH-ului, reunificarea corectă a lanțurilor complementare devine dificilă din cauza împerecherii
formarea bazei de regiuni complementare local în cadrul aceluiași lanțuri sau diferite.

Renaturarea ADN-ului are loc la o temperatură cu ~200C sub temperatura de topire.
În timpul renaturarii, secțiunile de lanțuri cu ADN repetat sunt mai întâi conectate și apoi cu secțiuni unice
curba de renaturare a ADN-ului
curba de dependență a t topiturii de concentrație. sare

Proprietățile ADN-ului

Ecografia taie ADN-ul în fragmente egale de ~500 bp lungime.
ADN-ul este insolubil în solvenți nepolari.
Alcalii hidrolizează ADN-ul.
Datorită încărcării grupelor fosfat, ADN-ul are o sarcină negativă.

Topologia moleculelor de ADN

Literatură:

1. Cantareata: Genes and Genomes Vol.1
2. Zenger.V: Principii de organizare structurală a acizilor nucleici. M., Mir, 1987

În 1944, experimentele conduse de Avery, McLeod și McCarthy au demonstrat că capacitatea de formare a capsulei a unei tulpini acapsulare mutante de pneumococi poate fi restabilită prin introducerea în celulele sale de ADN pneumococic purificat capabil de sinteza capsulei. Autorii au numit agentul (ADN) responsabil pentru această schimbare un „factor de transformare”. Foarte curând metoda de transformare a devenit utilizată pe scară largă în cercetarea genetică. Relativ recent, au fost efectuate experimente în care drojdia, celulele de mamifere, embrionii de rozătoare și insecte au servit drept receptori, iar ADN-ul clonat a servit ca donator de informații genetice.

Proprietățile chimice ale ADN-ului

Natura chimică a unităţilor monomerice care formează ADN (deoxiadenilat, deoxicitidilat, deoxiguanilat şi timidilat) este descrisă în Capitolul. 34. Monomerii polimerizează pentru a forma legături 3, 5-fosfodiester, formând o singură catenă de ADN (Fig. 37. 1). Informațiile din ADN sunt scrise sub forma unei secvențe specifice de dezoxiribonucleotide de purină și pirimidină.

Molecula de polimer ADN, după cum se poate observa din figură, este polară. La un capăt există un 5-hidroxil - (sau o grupare fosfat), la celălalt există un 3-fosfat - (sau o grupare hidroxil). Pe baza datelor din analiza de difracție cu raze X a ADN-ului și a regulii lui Chargaff, conform căreia într-o moleculă de ADN conținutul de reziduuri de deoxiadenozină (A) este egal cu conținutul de timidină (T), iar conținutul de deoxiguanozină (G) este egal cu conținutul de deoxicitozină (C), Watson, Crick și Wilkins au propus la începutul anilor 50 modelul structurii dublu catenare a ADN-ului. Modelul ADN-ului B-form este prezentat în Fig. 37.2. Cele două catene ale acestei molecule cu dublu elicoidal drepte sunt ținute împreună prin legături de hidrogen formate între bazele purinice și pirimidinice. Formarea perechilor complementare este strict specifică. A se împerechează întotdeauna cu (Fig. 37. 3).

Într-o moleculă dublu catenară, restricții cauzate de inhibarea rotației în jurul legăturii fosfodiester, „autoconfigurarea” predominantă a legăturilor glicozidice (Fig. 34.9) și formele tautomerice predominante ale celor patru baze (A, G, T și C, Fig. 34.3) creează condiții în care A poate forma o pereche puternică numai cu T, iar G numai cu C (Fig. 37.3). Acesta este exact ceea ce explică regulile lui Chargaff (A = T; G ​​​​= C). Cele două fire ale unei duble helix, fiind polare, sunt

Orez. 37.1. Un fragment al structurii unei molecule de ADN în care bazele purinice și pirimidinice adenină (A), timină (T), citozină (C) și guanină (G) sunt ținute împreună printr-o coloană vertebrală fosfodiester care conectează reziduuri dezoxiribozil legate printr-un - legătură glicozidică cu bazele nucleice corespunzătoare. Vă rugăm să rețineți: coloana vertebrală fosfodiesterică a unui singur lanț de ADN are „polaritate” (adică o anumită direcție poate fi distinsă în ea, de exemplu).

antiparalel, adică direcția unui lanț este , iar celălalt este . Această imagine seamănă cu două străzi paralele cu trafic cu sens unic direcționat în direcții opuse. Una dintre cele două catene de ADN complementare, care conține informații despre structura unei anumite gene sub forma unei secvențe de nucleotide specifice, este de obicei numită codificare (sau șablon); celălalt lanț complementar acestuia se numește necodificare.

După cum se arată în Fig. 37.3, se formează trei legături de hidrogen între resturile de deoxiguanozină și deoxicitidină și doar două între timidină și deoxiadenozină. Prin urmare, legătura G-C este cu aproximativ 50% mai puternică. Această circumstanță, precum și interacțiunile de stivuire, pot explica temperatura mai mare de denaturare (topire) a regiunilor bogate în G-C ale ADN-ului.

Structura ADN-ului

ADN-ul poate forma mai multe tipuri de elice duble. În prezent, sunt deja cunoscute șase forme (de la A la E și forma Z). Majoritatea variantelor structurale ale ADN-ului pot exista doar în condiții experimentale strict controlate. Aceste opțiuni diferă în 1) numărul de perechi de baze pe tură a dublei helix; 2) distanța dintre planurile perechilor de baze și unghiul pe care acestea îl formează cu axa helixului; 3) diametrul spiralei; 4) direcția (dreapta, stânga) a dublei elice (Tabelul 37. 1).

Unele dintre aceste forme se schimbă unele în altele cu modificări ale concentrației de sare și ale gradului de hidratare. Este posibil ca tranzițiile între diferite forme structurale de ADN să aibă loc și in vivo.

Orez. 37.2. Modelul Watson și Crick al structurii duble helix în formă B. Stânga: Reprezentarea schematică a moleculei (A - adenină, C - citozină, G - guanină, T - timină, P - fosfat, S-zahăr [dezoxiriboză]). Dreapta: Model al structurii ADN-ului. (Fotografie de la J.D. Watson, Molecular biology of the Gene 3rd ed. Copyrght 1976, 1970, 1965 by W. A. ​​​​Benjamin, Inc., Menlo Park, California)

În condiții fiziologice (concentrație scăzută de sare, grad ridicat de hidratare), tipul structural dominant de ADN este forma B. Pasul de helix al unei astfel de molecule este de 3,4 nm. O bobină de ADN poate fi considerată ca două stive răsucite de „monede”, fiecare conținând 10 monede. Stivele sunt ținute împreună prin legături de hidrogen între două „monede” opuse ale stivelor și sunt „înfășurate” de două panglici de coloană vertebrală de fosfodiester răsucite într-o spirală dreaptă. În condiții de hidratare mai puțin ridicată și cu un conținut mai mare de ioni Na+ sau K+, apare o structură puțin diferită - așa-numita formă A. Această conformație dreaptă are un diametru de helix mai mare decât forma B și un număr mai mare de perechi de baze pe tură. Este similar cu structura caracteristică a duplexurilor ARN sau ARN-ADN dublu catenar. Formele C-E sunt, de asemenea, dreptaci, formarea lor poate fi observată doar în experimente speciale și, aparent, nu există in vivo.

în formă de Z. ADN-ul este un dublu helix stânga în care coloana vertebrală fosfodiesterică este situată într-un model în zig-zag de-a lungul axei moleculei. De aici și numele moleculei (zigzag)-DNK. Z-DNA este ADN-ul cel mai puțin răsucit (12 perechi de baze pe tură) și cel mai subțire cunoscut în natură și are doar un canal (vezi mai jos). Z-ADN este detectat în secvențe repetate de deoxinucleotide purinice și pirimidinice alternative (GC sau AC) în prezența unui număr de alți factori stabilizatori. Acestea includ: 1) concentrație mare de sare sau prezența cationilor specifici, cum ar fi spermina și spermidina; 2) un conținut ridicat de superturnuri negative în molecula de ADN (vezi capitolul 38); 3) legarea proteinelor Z-ADN-specifice; 4) metilarea carbonului-5 a unor resturi de deoxicitidină.

ADN-ul în forma Z poate participa la reglarea expresiei genelor atât strâns situate cât și semnificativ îndepărtate de situl Z. Unele proteine ​​care se leagă în șanțul major sau minor al ADN-ului formei B sunt probabil incapabile să se lege de ADN-ul formei Z. În plus, inversarea unei secțiuni de ADN de la forma Z la forma ADN-ului B, care are loc, de exemplu, ca urmare a pierderii grupărilor metil de către -metildeoxicitidină. poate influența starea de torsiune a secțiunilor de ADN situate la o distanță considerabilă de zona de reversie.

Orez. 37.3. Formarea a două legături de hidrogen (linie întreruptă) între bazele deoxiadenozină și timidină (sus) și a trei legături de hidrogen între bazele deoxiguanozină și deoxicitidină (jos). În ADN, restul de carbohidrați este 2-deoxiriboză, în ARN D-riboză

Răsucirea torsională și derularea ADN-ului, precum și metilarea deoxicitidinei, afectează probabil activitatea genelor (vezi mai jos).

Prezența ADN-ului Z în cromozomii Drosophilei (musca fructelor) a fost demonstrată folosind anticorpi specifici formei Z a ADN-ului. Există regiuni din ADN-ul uman care se pot transforma potențial în forma Z; sunt dispersate în genom.

Tabelul 37.1. Caracteristicile unor tipuri de structuri ADN

Există motive să credem că condițiile necesare pentru stabilizarea formei Z pot fi realizate și în celulele umane.

Denaturarea (topirea) ADN-ului

Structura dublu catenară a ADN-ului poate fi „topită” în soluție prin creșterea temperaturii sau scăderea concentrației de sare. În timpul topirii, nu numai catenele de ADN diverg, dar și sistemul de interacțiuni de stivuire a bazelor nucleice într-un anumit lanț este de asemenea perturbat. Legăturile fosfodiesterice nu sunt rupte. Denaturarea ADN-ului este însoțită de absorbția optică crescută a bazelor purinice și pirimidinice. Acest fenomen se numește efectul hipercromic al denaturarii ADN-ului. Denaturarea elimină, de asemenea, vâscozitatea ridicată inerentă soluțiilor de ADN nativ, a cărei structură asemănătoare fibrei se datorează atât interacțiunilor de stivuire a bazelor nucleice în fiecare lanț, cât și interacțiunilor complementare dintre cele două lanțuri.

Separarea lanțurilor unei anumite molecule de ADN are loc într-un anumit interval de temperatură. Punctul de mijloc al acestui interval se numește temperatura de topire a ADN-ului sau . Valoarea depinde de compoziția de nucleotide a ADN-ului și de concentrația de sare din soluție. Moleculele de ADN îmbogățite în perechi G-C (sunt conectate prin trei punți de hidrogen) „se topesc” la o temperatură mai mare decât moleculele bogate în A-T (perechile A-T sunt conectate prin două punți de hidrogen). O creștere de zece ori a concentrației de cationi monovalenți crește cu 16,6 ° C. Formamida, utilizată în mod obișnuit în experimentele cu ADN recombinant, destabiliza legăturile de hidrogen dintre baze, reducând astfel . Acest lucru permite ca șuvițele hibride ADN sau ADN-ARN să divergă la temperaturi mai scăzute, ceea ce reduce probabilitatea ca rupturile individuale ale catenei să apară la temperaturi ridicate.

Caneluri în structura ADN-ului

Când studiem modelul prezentat în Fig. 37.2, puteți acorda atenție prezenței în structura ADN-ului a canelurilor majore și minore, răsucite în jurul axei moleculei paralele cu coloana vertebrală fosfodiester. În aceste șanțuri, proteinele pot interacționa în mod specific cu anumiți atomi ai bazelor nucleice și, prin urmare, „recunoaște” secvențe de nucleotide specifice fără a perturba interacțiunile complementare în structura dublei helix. După cum va fi arătat în cap. 39 și 41, prin astfel de interacțiuni proteinele reglatoare pot controla expresia genelor.

ADN relaxat și supraîncolăcit

ADN-ul unor organisme, cum ar fi bacteriile, bacteriofagii și multe virusuri animale care conțin ADN, este o structură de inel închis. Desigur, o astfel de structură nu încalcă polaritatea moleculelor, dar grupele libere și -hidroxil și fosforil dispar în ea. Inelele închise pot exista în forme relaxate sau supraînfăşurate. Superhelicitatea apare atunci când un inel închis se pliază în jurul propriei axe sau când o secțiune de ADN liniar ale cărei capete sunt fixe se răsucește. Acest proces consumator de energie are ca rezultat apariția tensiunii intramoleculare în structură. Pe măsură ce numărul de super ture crește, efortul intern (de torsiune) crește (verificați acest lucru pe o bandă de cauciuc obișnuită). Superbobinele din ADN formate prin răsucirea în sens invers acelor de ceasornic (în direcția opusă răsucirii dublei helix din dreapta a ADN-ului formei B) se numesc bobine negative. Într-un fel, putem considera că energia necesară pentru a obține o astfel de stare structurală este stocată în superbobine obișnuite (nenegative). Energia de tranziție a unei molecule de ADN la un alt tip de structură supramoleculară poate fi redusă datorită formării zonelor de răsucire negativă. O astfel de tranziție este separarea catenelor în pregătirea pentru replicare și transcripție. Acesta este motivul pentru care supraînfăşurarea ADN-ului este foarte avantajoasă în sistemele biologice. Enzimele care catalizează modificări topologice în molecula de ADN sunt numite topoizomeraze. Cea mai studiată dintre ele este giraza bacteriană, care inițiază formarea superbobinelor negative.

Funcția ADN-ului

Informațiile genetice codificate în secvențele de nucleotide servesc la două scopuri. În primul rând, este necesar pentru sinteza moleculelor de proteine ​​și, în al doilea rând, asigură transmiterea lui însuși într-un număr de generații celulare și generații de organisme. Ambele funcții se bazează pe molecula de ADN care servește ca șablon; în primul caz pentru transcripție - recodificarea informațiilor în structura moleculelor de ARN și în al doilea pentru replicare - copierea informațiilor în moleculele de ADN fiice.

Complementaritatea catenelor cu dublu helix Watson și Crick sugerează un mod semiconservator de replicare a ADN-ului. Aceasta înseamnă că lanțurile diverg și fiecare servește ca șablon pentru sinteza unei noi secvențe complementare (Fig. 37.4). Cele două molecule de ADN dublu catenar rezultate, fiecare constând dintr-un părinte și o catenă complementară nou sintetizată, sunt distribuite între cele două celule fiice (Fig. 37.5). Astfel, fiecare dintre celulele fiice primește informații identice cu cele deținute de celula părinte. Fiecare dintre cele două celule fiice păstrează o catenă a ADN-ului parental original.

Mecanismul semiconservator de replicare în bacteria Escherichia coli a fost demonstrat clar în experimentul clasic al lui Meselson și Stahl folosind un izotop greu de azot combinat cu centrifugare la echilibru.

Orez. 37.4. Structura ADN-ului dublu catenar. Fiecare dintre cele două catene ale moleculei de ADN părinte este utilizată ca șablon pentru sinteza noilor catene complementare. (Din J. D. Watson. Molecular biology of the Gene 3rd ed. Copyright 1976, 1970, 1965 by W. A. ​​​​Benjamin, Inc., Menlo Park,

Orez. 37,5. Distribuția așteptată a catenelor de ADN în timpul replicărilor semi-conservative și conservatoare. În imagine, lanțurile părinte sunt negre, iar noile lanțuri sunt ușoare. (Redesenat și reprodus, cu permisiunea lui Lehninger A. L. Biochemistry Ed. 2, Worth, 1975.)

ADN-ul de E. coli și ADN-ul uman sunt identice din punct de vedere chimic, deși, desigur, secvențele de nucleotide din ele sunt diferite și, în plus, o celulă umană conține de aproximativ 1000 de ori mai mult ADN decât o celulă bacteriană. S-a dovedit că mecanismul chimic al replicării ADN-ului este același la procariote, cum ar fi E. coli, și eucariote, inclusiv oameni, în ciuda faptului că enzimele implicate în aceste procese diferă în celulele procariotelor și eucariotelor. Există toate motivele să credem că datele obținute din studiul chimiei acizilor nucleici din organismele procariote sunt aplicabile și sistemelor eucariote. Într-adevăr, rezultatele experimentelor cu celule de mamifere, similare cu cele ale lui Meselson și Stahl, s-au dovedit a fi comparabile cu datele obținute anterior asupra E. coli.

Dacă încălziți încet soluții de ADN viral sau bacterian, moleculele acestora se denaturază la temperaturi foarte specifice (Fig. 27-16). Trecerea de la duplexul de ADN nativ la forma nerăsucită, încolăcită aleatoriu, denaturată poate fi detectată printr-o creștere a absorbției luminii ultraviolete sau o scădere a vâscozității soluției de ADN. Fiecare tip de ADN are propria sa temperatură de denaturare, numită „punct de topire”. Cu cât este mai mare conținutul de perechi G=C în ADN, cu atât este mai mare punctul de topire al acestui ADN. Acest lucru se explică prin faptul că perechile GC sunt mai stabile și disocierea lor necesită mai multă energie decât distrugerea perechilor A=T; Acest lucru se datorează parțial faptului că perechile G=C sunt conectate prin trei legături de hidrogen, iar perechile A=T doar prin două.

Determinarea atentă a punctului de topire al unui preparat de ADN în condiții fixe de pH și forță ionică poate oferi, prin urmare, informații despre raportul perechilor A=T și G=C din ADN.

A doua proprietate fizică a ADN-ului, datorită raportului dintre perechile G=C și A=T, este densitatea plutitoare. Un preparat de ADN cu un conținut mai mare de G=C-nap are o densitate puțin mai mare decât ADN-ul cu un conținut mai mare de perechi A=T. Preparatele de ADN sunt centrifugate la viteze mari într-o soluție concentrată de clorură de cesiu (), a cărei densitate este în același interval cu densitatea ADN-ului.

Orez. 27-15. Principiul testului de hibridizare. Două preparate de ADN izolate din organisme de diferite specii sunt încălzite astfel încât să fie complet denaturate și lanțurile lor separate. Când aceste medicamente sunt amestecate și răcite lent, catenele de ADN complementare ale fiecărui tip se vor găsi reciproc și se vor renatura pentru a forma duplexuri normale. Dacă există omologie de secvență semnificativă între două ADN-uri, atunci este posibilă formarea de molecule hibride care sunt duplexuri parțiale. Cu cât este mai mare gradul de omologie, cu atât este mai mare probabilitatea formării hibrizilor. Conținutul de hibrizi dintr-un amestec poate fi măsurat în diferite moduri, în special folosind cromatografie sau centrifugare cu gradient de densitate. De obicei, pentru a simplifica procedura de măsurare, unul dintre ADN-uri este marcat cu un izotop radioactiv.

Orez. 27-16. Curba de denaturare (topire) a două preparate de ADN. Temperatura corespunzătoare punctului de mijloc al tranziției se numește punct de topire. Deoarece valoarea depinde de pH și concentrația de sare, este întotdeauna necesar să se specifice condițiile pentru măsurarea acesteia.

La centrifugare într-un tub de centrifugă, se formează un gradient de densitate cu cea mai mare densitate în partea inferioară a tubului. Dacă puneți ADN-ul în el, acesta se va deplasa mai întâi spre fundul eprubetei, dar apoi la o anumită poziție se va opri și va pluti. În această poziție, nu poate nici să plutească, nici să se așeze, deoarece densitatea soluției aici este egală cu densitatea acesteia. Folosind această metodă, descrisă mai detaliat în Cap. 28, moleculele de ADN care diferă în conținutul perechilor G=C pot fi separate unele de altele, deoarece au densități de plutire diferite. Pe baza densității plutitoare a unui ADN dat, putem calcula raportul dintre perechile G=C și A=T din acesta.

Hibridarea ADN-ului

Hibridarea ADN-ului, hibridizarea acidului nucleic- conexiune in vitro acizi nucleici monocatenar complementari într-o moleculă. Cu complementaritate completă, fuziunea are loc ușor și rapid, iar în cazul necomplementarității parțiale, fuziunea lanțurilor încetinește, ceea ce face posibilă aprecierea gradului de complementaritate. Hibridizarea ADN-ADN și ADN-ARN este posibilă.

Protocol experimental

1. ADN-ul dublu catenar este încălzit într-un tampon adecvat. Datorită modificărilor condițiilor externe, legăturile de hidrogen dintre bazele azotate complementare devin termodinamic nefavorabile și lanțurile diverg.
2. Preparatul de ADN denaturat este amestecat cu alt ADN denaturat.
3. Preparatele sunt răcite lent, în timp ce ADN-ul monocatenar se alipește unul cu celălalt (se formează legături de hidrogen între bazele complementare) și se formează o moleculă de ADN „hibridă”.

Analiza vitezei de recoacere ADN monocatenar permite evaluarea asemănărilor și diferențelor în secvențele ADN între specii sau indivizi din aceeași specie.

Calcularea temperaturii de topire a ADN-ului

Structura secundară a ADN-ului joacă un rol important în biologie, diagnosticare genetică și alte metode de biologie moleculară și nanotehnologie. Prin urmare, determinarea precisă a temperaturii de topire a moleculelor de ADN sau ARN joacă cel mai important rol în toate metodele biologice moleculare, de exemplu, cum ar fi selecția de probe sau oligonucleotide pentru microarrays sau pentru selectarea primerilor PCR. Există mai multe formule simple pentru calcularea temperaturii de topire pentru oligonucleotidele scurte. Calculul brut al temperaturii de topire (Tm) a unei oligonucleotide scurte (<20 нуклеотидов) проводят по прямому подсчету количества нуклеотидов (G+C - сумма всех гуанинов и цитозинов , L - длина олигонуклеотида):

Formula medie pentru calcularea Tm pentru o oligonucleotidă scurtă (și pentru fragmente lungi de ADN), ținând cont de concentrația ionilor K + și DMSO:

Cu toate acestea, aceste ecuații nu iau în considerare inițierea legării în timpul hibridizării oligonucleotidelor și nici nu țin cont de caracteristicile secvenței în sine și de efectul terminal caracteristic duplexurilor de oligonucleotide. Prin urmare, această formulă este mai potrivită acolo unde secvența de ADN este mediată și lungimea duplexului este de peste 40 de nucleotide.

termodinamica ADN-ului

Cea mai comună metodă folosită astăzi pentru a calcula temperatura de topire a ADN-ului dublu sau monocatenar se bazează pe un model termodinamic în două etape. Două molecule de ADN complementare A și B, fie legate între ele, fie libere în soluție („stare aleatoare a bobinei”). De obicei, se presupune că ambele molecule A și B sunt complet complementare, astfel încât hibridizarea lor este evidentă, iar una sau mai multe erori de complementaritate sunt permise în duplex, inclusiv perechile G-G, G-T și G-A necomplementare (perechile vobble). În cazul unei singure molecule, se presupune că este ambalată într-o structură de buclă. Procesul de hibridizare în duplex este descris prin formula:

unde A și B sunt lanțuri diferite în soluție („stare aleatoare a bobinei”), iar AB este un duplex format. Această reacție este reversibilă. Constanta de echilibru k pentru această reacție este definită ca: .

Constanta de echilibru depinde de concentrația lanțului, temperatură, concentrația de sare, pH și alte componente din reacție (de exemplu, glicerol sau DMSO). Constanta K se modifică ca răspuns la o modificare a concentrației unuia sau ambelor lanțuri (și/sau), apoi întregul sistem răspunde la modificări și apoi concentrațiile individuale [A], [B] și se vor schimba, de asemenea. De exemplu, dacă există mai mult lanț A în sistem, atunci concentrația va crește. Să presupunem că constanta de echilibru este 1,81x10 6 și concentrația de lanțuri = = 10 -5 M:

Inlocuim componentele in formulele pentru a calcula k:

După rearanjare obținem:

De exemplu, înlocuiți = 7,91x10 -6 M în această formulă, atunci concentrația de lanțuri va fi [A] = [B] = 2,09x10 -6 M. Adică doar 79% din lanțuri vor fi conectate într-un duplex. .

Este posibil să se determine constantele de echilibru atunci când temperatura se schimbă? Acest lucru ne aduce la înțelegerea parametrilor termodinamici importanți, cum ar fi energia liberă (dG), entalpia (dH) și entropia (dS). Modificări ale energiei libere, entalpiei și entropiei apar în timpul tranziției de la „temperatura de hibridizare T” la o stare dezordonată, aleatorie. Aceste rapoarte sunt date de formula dG = dH – TdS, (pentru concentrația de lanț [A] = [B] = = 1M), atunci formula ideală pentru calcularea energiei libere Gibbs este:

unde T este temperatura în kelvin, dH° (cal/mol) și dS° (cal/mol K).

Există o relație utilă care leagă modificarea energiei libere Gibbs în timpul unei reacții chimice cu constanta sa de echilibru:

unde R este constanta universală a gazului (1,987cal/mol K).

Combinând ambele formule obținem:

Punctul de topire (T m) este determinat la echilibru, când jumătate dintre lanțuri sunt conectate între ele, iar cealaltă jumătate este în stare liberă, adică k = 1:

Punctul de topire pentru o buclă simplă este calculat ca . Pentru un duplex ADN, trebuie luată în considerare concentrația fiecărei catene (în moli, M). Astfel, dacă [A] și [B] sunt concentrațiile moleculelor A și B, atunci concentrația totală a lanțurilor, C, este egală cu suma lor, [A] + [B].

Se presupune că concentrația ambelor lanțuri este aceeași [A] = [B] = C/2. În acest caz,

unde f = 4. Pentru o oligonucleotidă autocomplementară = C și apoi f = 1. Acest punct de topire se determină numai în cazul în care jumătate dintre molecule sunt legate între ele.

Pentru o oligonucleotidă auto-complementară, k = 1/ prin urmare:

Pentru un duplex necomplementar, când ≥ , k =1/( – /2), Tm se calculează după cum urmează:

unde este concentrația molară a lanțului predominant (de obicei un primer PCR) și [Bt] este concentrația molară a lanțului cu o concentrație scăzută (ADN genomic).

Calculul punctului de topire

Parametrii termodinamici dG, dH și dS sunt calculați pe baza modelului cel mai apropiat vecin. Pentru a prezice cu precizie structura secundară a ADN-ului în timpul hibridizării folosind algoritmi de programare dinamică, este necesară o bază de date pentru toți parametrii termodinamici posibili pentru fiecare pereche de baze complementară, precum și pentru toate variantele de nucleotide nepotrivite, capete libere, ace de păr și bucle. Formula termodinamică pentru calcularea unei oligonucleotide scurte se bazează pe parametrii termodinamici - entropia dS și entalpia dH, pentru fiecare dintre cele 10 combinații de patru nucleotide (Tabelul 1). Tabelul 1 prezintă parametrii termodinamici pentru cei mai apropiați vecini (NN) pentru perechile de nucleotide la o concentrație de 1 M NaCl.

Pentru a calcula Tm (°C), toate valorile energiei libere Gibbs sunt însumate pentru fiecare pereche cu un pas de o nucleotidă:

dG total = dG initial + dG simetrie +∑dG + dG AT final

dG teoretic = 1,96 + 0 - 2,17 – 1,44 – 1,44 – 1,00 – 1,45 – 1,30 +0,05

dG teoretic = -5,35 kcal/mol

Valorile entropiei (dH = -43,5 kcal/mol) și entalpiei (dS = -122,5) sunt calculate în mod similar:

Multe duplexuri de ADN au structuri monocatenar concurente, iar acest lucru schimbă echilibrul sistemului și, ca urmare, reduce valoarea T m de la valoarea prezisă de formulă.

Formula generală pentru calcularea T m corectată pentru sare în soluție:

unde L este lungimea oligonucleotidei, R este constanta gazului (1,987cal/K mol), c este concentrația oligonucleotidei în (de obicei 2x10−7 M), este concentrația ionilor de potasiu în moli (de obicei 5x10−). 2 M).

Tabelul 1. Parametrii termodinamici pentru cei mai apropiați vecini (NN) pentru perechile de nucleotide la o concentrație de 1 M NaCl,

Succesiunea de perechi (5"-3"/3"-5")	° kcal/mol	° cal/(mol K)	° 37 kcal/mol
AA/TT	-7.6	-21.3	-1.00
AT/TA	-7.2	-20.4	-0.88
TA/AT	-7.2	-20.3	-0.58
CA/GT	-8.5	-22.7	-1.45
GT/CA	-8.4	-22.4	-1.44
CT/GA	-7.8	-21.0	-1.28
GA/CT	-8.2	-22.2	-1.30
CG/GC	-10.6	-27.2	-2.17
GC/CG	-9.8	-24.4	-2.24
GG/CC	-8.0	-19.9	-1.84
iniţiere	+0.2	-5.7	+1.96
perechea terminalului A-T	+2.2	+6.9	+0.05
corectarea simetriei	0.0	-1.4	+0.43

O singură eroare în duplex

Cel mai apropiat model de vecin pentru perechile de nucleotide complementare poate fi extins la perechi care implică nucleotide necomplementare. S-a demonstrat că există o tendință ca stabilitatea perechilor de baze necomplementare să scadă în ordine descrescătoare:

G-C > LA> G·G > G·T ≥ G·A > T·T ≥ A·A > T·C ≥ A·C ≥ C·C

Guanidina G este cea mai promiscuă bază deoarece formează perechi de baze puternice cu baze necomplementare (G·G, G·T și G·A). Pe de altă parte, citozina C este cea mai discriminatorie bază, deoarece formează cele mai stabile perechi complementare și perechi instabile cu baze necomplementare (T·C ≥ A·C ≥ C·C).

Legături

Vezi si

• PrimerDigital: instrumente online pentru analiza PCR și oligonucleotide