Домой Деревья и кустарники Днк плавление. Физико-химические свойства днк Релаксированная и суперспиральная ДНК

Деревья и кустарники

Днк плавление. Физико-химические свойства днк Релаксированная и суперспиральная ДНК

Физико-химические свойства ДНК

Наименование параметра	Значение
Тема статьи:	Физико-химические свойства ДНК
Рубрика (тематическая категория)	Спорт

1. Денатурация

Денатурация ДНК осуществляется при действии химических факторов (мочевина, гуанидинхлорид, кислота, щелочь) и физических факторов (температура). В результате денатурации происходит разрушение вторичной структуры ДНК. При снятии воздействия денатурирующего фактора вторичная структура ДНК должна быть восстановлена. Это процесс носит название – ренатурация˸

Денатурация, или плавление, ДНК сопровождается увеличением оптической плотности растворов ДНК при длине волны 260 нм. Данное явление получило название – гиперхромный эффект. Максимальное повышение оптической плотности раствора ДНК при полном распаде её до мононуклеотидов при указанной длине волны приблизительно равно 80 %.

Молекула ДНК, состоящая только из поли-д(АТ), плавится при более низких температурах, чем молекула ДНК, состоящая из поли-д(ГЦ). Это связано с тем, что между А и Т образуются две водородные связи, а между Г и Ц – три водородные связи.

2. Температура плавления

Важнейшей характеристикой ДНК является её температура плавления, которая соответствует той температуре, при которой увеличение оптической плотности раствора ДНК равна половине максимального её увеличения, наблюдаемого при полной денатурации ДНК. Температура плавления ДНК, состоящей из поли-д(АТ), равна 66 о С, ДНК, состоящей из поли-д(ГЦ), – 85 о С. Природные ДНК имеют температуру плавления более 66 о С, но менее 85 о С, потому что в их состав входят все четыре азотистых основания, но в различных пропорциях у разных живых организмов. Так ДНК человека характеризуется температурой плавления, равной 81 – 82 о С, E.coli – 90,5 о С.

При охлаждении раствора ДНК (отжиге) может происходить восстановление исходной вторичной структуры ДНК в соответствии с принципом комплементарности.

3. Гибридизация

Если смесь различных молекул ДНК изначально расплавить, а затем провести их отжиг, то при наличии сходства в их первичных структурах между молекулами ДНК возможна гибридизация.

Рисунок – Гибридизация между различными молекулами ДНК

Чем выше сходство между молекулами ДНК, тем выше степень гибридизации. На основании результатов гибридизации между ДНК различных видов живых организмов можно судить о их родстве. Чем выше степень гибридизации, тем ближе родство между анализируемыми видами.

Гибридизация также возможна и между молекулами ДНК и РНК, при условии наличия гомологичных нуклеотидных последовательностей.

Рисунок – Гибридизация между ДНК и РНК

4.Нуклеиновые кислоты сильно поглощают ультрафиолетовый свет, и это свойство лежит в базе определения их концентрации. С этим же свойством связан и мутагенный эффект ультрафиолетового света.

Организация ДНК эукариот

Длина молекулы ДНК эукариот многократно превышает размеры клетки. Для обеспечения протекания различных биологических процессов она должна соответствующим образом быть упакована. Существуют несколько уровней её компактизации.

1. Голая ДНК – представляет собой двойную спираль, её диаметр равен 1,8 нм˸

Такая ДНК обладает сверхчувствительностью к ДНКазам – ферментам, гидролизующим фосфодиэфирные связи.

Физико-химические свойства ДНК - понятие и виды. Классификация и особенности категории "Физико-химические свойства ДНК" 2015, 2017-2018.

структура ДНК
формы ДНК
нуклеотидный состав ДНК
плавление ДНК
топология ДНК
ДНК - молекула, состоящая из двух антипараллельных молекул соединенных водородными связями по принципу комплементарности с образованием спиральной структуры.

Структура ДНК

Структурной единицей цепи ДНК является дезоксирибонуклеозид, состоящий из фосфата, сахара-дезоксирибозы и четырех нуклеотидов: аденина (A), цитозина (C), гуанина (G) и тимина (T). У некоторых фагов Тимин замещен Урацилом (фаг PBS1), который обычно входит в состав РНК. Нуклеотиды двух цепей ДНК соединены водородными связями по принципу комплементарности: А-T, G-C.пурины (2кольца) -Аденин, Гуанин пиримидины -Тимин, Цитозин |
d DNA=20A; - на пурин-12A, на пиримидин-8A |
В паре A-Т 2 H-связи, в паре Г-Ц – 3 |
Вращающаяся молекула ДНК
Tаутомерия оснований
В гетороциклах протоны связанные с азотом могут переходить
на другие атомы азота или на атомы кислорода кетогруппы и в растворах будет существовать равновесие различных таутомерных структур быстро переходящих друг в друга.
В результате таутомерых превращений U и G в енольной форме при спаривании могут имитировать С и А, а С и А в иминоформе - U и G, что может привести к мутациям в ДНК (рис.).
Стекинг взаимодействие
Основания в цепи ДНК лежат друг над другом в стопке, что обеспечивает дополнительную стабилизацию цепи - стекинг взаимодействие.
Величина стекинг взаимодействия между основаниями: пурин-пурин>пиримидин-пурин>пиримидин-пиримидин
В олиго- и полинуклеотидах стэкинг между соседними основаниями приводит к формированию стабильной одноцепочечной спиральной структуры (polyA) а отсутствие стекинга к разупорядоченному клубку (polyU)
Энергия стекинг взаимодействий ~ -3 - -15 ккал/моль
Сахарофосфатный остов снаружи основания внутри дезоксиробозофосфаты соединены фосфодиэфирными связями. ОН-группы фосфата соединены
с ОН-группой 3"- и 5"-углеродами дезоксирибозы.
Ошибочное спаривание может происходить, когда тимин находится в енольной форме или цитозин находится в имино форме.

Модификации нуклеотидов

рис.1 Модифицированные нуклеотиды [Сингер].

Нуклеотиды в ДНК могут подвергаться модификациям: 5-метилцитозин,
5-гидроксиметилцитозин, 5-гидроксиметилурацил,
N-метиладенин. В ДНК некоторых бактериофагов к гидроксиметильной группе гидроксиметилцитозина присоединены с помощью гликозидной связи моно- или дисахариды. ДНК большинства низших эукариот и беспозвоночных содержат относительно мало 5-метилцитозина и
N6-метиладенина. У позвоночных метилирование оснований играет
важную роль в регуляции экспрессии генов, причем наиболее распространен 5-метилцитозин. Показано, что
более 95% метильных групп в ДНК позвоночных содержится в остатках цитозина редко встречающихся CG-динуклеотидов и более 50% таких динуклеотидов метилировано. У растений 5-ме-тилцитозин можно обнаружить в динуклеотидах CG
и тринуклеотидах CNG (N – C, А или Т).

Формы ДНК

Параметры	B-форма	А-форма	С-форма	Z-форма
спираль	правозакручена	правозакручена	правозакручена	левозакручена
ед. повтора	1 пн	1пн	1пн	2пн
пн в обороте	10,4	10,7	9.3	12
диаметр	23,7А	25,5А		18,4А
вращение/пн	35,9	33,6	38,7	60/2
наклон пн к оси	-1,2	+19		-9
раст. м-у пн вдоль оси	0.332 nm	0.23 nm		0.38 nm
длина оборота	34А	28А	31А	34,4А

При исследовании ДНК различными методами обнаружено наличие различных форм ДНК образуемые при различных условиях (концентрации солей, влажность), некоторые из которых способны существовать в живых организмах.

Существуют A, B, C, D, T-семейства форм ДНК, которые могут быть подразделены на различные подтипы (C", C"").
В-ДНК - основное состояние ДНК показанное на кристаллах и в водных растворах.
С-ДНК - форма существующая при пониженной концентрации Na и влажности 44-66%, если GC=31-72%.
А-ДНК - такая форма образуется у гибридов ДНК-РНК, следовательно при транскрипции ДНК переходит в А-форму, в месте контакта RNA-pol. Для этой формы характерно наличие внутренней пустоты диаметром 5A.

Z-ДНК - левозакрученная формаПереходу B-->Z способстует наличие GC-5" последовательности являющейся местом метилирования у организмов. Такие последовательности в плазмидах при сверхспирализации переходят из B в Z форму.
При B-->Z переходе участок в 11 пн имеет переходную форму между левой и правой спиралью.
Z-ДНК обнаружена в междисках политенных хромосом D. melanogaster.

Полинуклеотид GC-5" находясь в В-форме при низкой концентрации соли образует нуклеосомы. При высоких концентрациях соли полинуклеотид GC-5" переходит в Z-форму которая не образует нуклеосом.
А-, Z- формы не могут существовать в водном растворе без дополнительных воздействий (белки, суперспирализация).

D-DNA - AT-богатые участки ДНК фага Т2, у которого цитозин заменен на 5"-гидроксиметилцитозин, единственная из известных природных ДНК находится в D-форме. Кроме того ДНК фага гликозилирована более чем на 70%.
Двойная спираль D-ДНК закручена сильнее чем B-ДНК и имеет глубокий малый желоб - удобнуюю полость для размещения воды и катионов.

3D-структуры ДНК

Искривление ДНК

Нуклеотидный состав ДНК

Правила Чаргафа
Нуклеотидный состав ДНК некоторых
организмов [Сингер].

Источник	А	G	C	T	A+T/G+C	A+G/T+C	G+C, мол.%
Бактериофаг λ Бактериофаг Т2 Escherichia coli Bacillus subtilis Вирус папилломы Шоупа Saccharomyces cerevisiae Chlamydomonas Цыпленок Мышь Корова Пшеница	26,0 32,5 23,8 29,0 26,6 31,3 19,6 27,9 28,9 27,3 27,2	23,8 18,2 26,0 20,7 24,5 18,7 30,2 21,2 21,1 22,5 22,6	24,3 16,72 26,4 21,3 24,2 17,1 30,0 21,5 20,3 22,5 22,8	25,8 32,6 23,8 29,0 24,7 32,9 19,7 29,4 30,0 27,7 27,4	1,08 1,86 0,91 1,38 1,05 1,79 0,65 1,34 1,44 1,22 1,20**	0,99 1,03* 0,99 0,99 1,04 1,00 0,99 0,96 1,00 0,99 0,99**	48 35* 52 42 49 36 60 43 41 44 45**

* 5-гидроксиметилцитозин
** включая 5-метилцитозин

У эукариот частота встречаемости 5"-CG-3"выше, чем 5"-GC-3", т.к. динуклеотид 5"-GC-3" подвергается метилированию, участвующему в регуляции экспрессии генов. У прокариот соотношение 5"-CG-3"/5"-GC-3" близко к случайному (см.таблица).

Размер молекул ДНК

Размер ДНК выражается в парах нуклеотидов (пн), или в тысяче пар нуклеотидов (тпн)

Источник

М, Да

Длина

пн

Тип структуры

Бактериофаг φХ174
SV40
Бактериофаг Т2
Хромосома Hemophilus influenzas
Хромосома Escherichia coli
Saccharomyces cerevisiae
Хромосома 1
Хромосома 12
Drosophila melanogaster
Хромосома 2
Хромосома 3
Хромосома 4

1,6 10 6
3,5 10 6
1,2 10 8
7,9 10 8
2,6 10 8

1,4 10 8
1,5 10 9

4 10 10
4,2 10 10
4 10 9

1,6 мкм
1,1 мкм
50 мкм
300 мкм
1 мм

50 мкм
500 мкм

15 мм
16 мм
1,5 мм

5 10 3
5,2 10 3
2 10 5
1,2 10 6
4 10 6

2,1 10 5
2,2 10 6

6,0 10 7
6,3 10 7
6 10 6

Кольцевая одноцепочечная
Кольцевая двухцепочечная
Линейная двухцепочечная
Неизвестен
Кольцевая двухцепочечная

Линейная двухцепочечная
Линейная двухцепочечная

Линейная двухцепочечная
Линейная двухцепочечная
Линейная двухцепочечная

Плавление ДНК

Денатурация или плавление - расхождение цепей ДНК при нагревании ДНК ~1000C или при повышении pH.
Расхождение цепей происходит из-за разрушения слабых водородных
связей и плоскостных взаимодействий между основаниями.
На денатурацию также влияют: ионы одно- и двухвалентных металлов, белки, нейтрализующие отрицательные заряды фосфатных групп.
Температура плавления ГЦ выше чем АТ . Для разрушения двух Н-связей АТ-пар требуется меньше энергии, чем для разрыва трех H-связей GС-пар, значения температуры и рН, при которых происходит денатурация, зависят от нуклеотидного состава ДНК.
кривая плавления ДНК
Денатурация – процесс обратимый, последующее восстановление двухцепочечной структуры ДНК может происходить даже при полном расхождении цепей. Процесс воссоединения, называемый ренатурацией, реассоциацией или отжигом, происходит при
понижении температуры или рН
При резком понижении температуры или рН правильное воссоединение комплементарных цепей затрудняется из-за спари-
вания оснований локально комплементарных участков в пределах одной или разных цепей.

Ренатурация ДНК происходит при температупе на ~200C ниже температуры плавления.
При ренатурации сначало соединяются участки цепей с повторенной ДНК и затем с уникальными участками
кривая ренатурации ДНК
кривая зависимости т плав от конц. соли

Свойства ДНК

Ультразвук режет ДНК на равные фрагменты ~500 пн в длину.
ДНК нерастворима в неполярных растворителях.
Щелочь гидролизует ДНК.
Благодаря заряду фосфатных групп, ДНК имеет отрицательный заряд.

Топология молекул ДНК

Литература:

Сингер: Гены и геномы т.1
Зенгер.В: Принципы структурной организации нуклеиновых кислот. М., Мир, 1987

В 1944 г. в экспериментах, проведенных Эвери, Маклеодом и Маккарти, было продемонстрировано, что способность к образованию капсулы у мутантного бескапсульного штамма пневмококков может быть восстановлена посредством введения в его клетки очищенной ДНК пневмококков, способных к синтезу капсулы. Авторы назвали агент (ДНК), ответственный за это изменение, - «трансформирующим фактором». Очень скоро метод трансформации стал широко использоваться в генетических исследованиях. Относительно недавно были проведены эксперименты, в которых реципиентами служили клетки дрожжей, млекопитающих, эмбрионы грызунов и насекомых, а донором генетической информации-клонированная ДНК.

Химические свойства ДНК

Химическая природа мономерных единиц, образующих ДНК (дезоксиаденилат, дезоксицитидилат, дезоксигуанилат и тимидилат), описана в гл. 34. Мономеры полимеризуются с образованием 3, 5-фосфодиэфирных связей, формируя одиночную цепь ДНК (рис. 37. 1). Информация в ДНК записана в виде определенной последовательности пуриновых и пиримидиновых дезоксирибонуклеотидов.

Полимерная молекула ДНК, как видно из рисунка, полярна. На одном конце расположена 5-гидроксил - (либо фосфатная группа), на другом 3-фосфат-(либо гидроксильная группа). Основываясь на данных рентгеноструктурного анализа ДНК и правиле Чаргаффа, согласно которому в молекуле ДНК содержание остатков дезоксиаденозина (А) равно содержанию тимидина (Т), а содержание дезоксигуанозина (G) равно содержанию дезоксицитозина (С), Уотсон, Крик и Уилкинс предложили в начале 50-х годов модель двухспиральной структуры ДНК. Модель В-формы ДНК изображена на рис. 37.2. Две цепи этой правозакрученной, двухспиральной молекулы удерживаются друг возле друга за счет водородных связей, образующихся между пуриновыми и пиримидиновыми основаниями. Образование комплементарных пар строго специфично. А всегда спаривается с (рис. 37. 3).

В двухцепочечной молекуле ограничения, обусловленные заторможенностью вращения вокруг фосфодиэфирной связи, преимущественная «автоконфигурация гликозидных связей (рис. 34.9) и превалирующие таутомерные формы четырех оснований (A, G, Т и С, рис. 34.3) создают условия, в которых А может образовать прочную пару только с Т, a G только с С (рис. 37.3). Именно этим и объясняются правила Чаргаффа (А = Т; G = С). Две цепи двойной спирали, будучи полярными, являются и

Рис. 37.1. Фрагмент структуры молекулы ДНК, в которой пуриновые и пиримидиновые основания аденин (А), тимин (Т), цитозин (С) и гуанин (G) удерживаются вместе фосфодиэфирным остовом, соединяющим -дезоксирибозильные остатки, связанные -гликозидной связью с соответствующими нуклеиновыми основаниями. Обратите внимание: фосфодиэфирный остов единичной цепи ДНК обладает «полярностью» (т. е. в нем можно выделить определенное направление, например ).

антипараллльными, т. е. направление одной цепи , а другой . Такая картина напоминает две параллельные улицы с односторонним движением, направленным в противоположные стороны. Одну из двух комплементарных цепей ДНК, содержащую информацию о структуре определенного гена в виде специфической последовательности нуклеотидов, обычно называют кодирующей (или матричной); другая, комплементарная ей цепь носит название некодирующей.

Как показано на рис. 37.3, между остатками дезоксигуанозина и дезоксицитидина образуются три водородные связи, а между тимидином и дезоксиаденозином - только две. Поэтому связь G-С прочнее примерно на 50%. Этим обстоятельством, а также стэкинг-взаимодействиями и можно объяснить более высокую температуру денатурации (плавления) G-С-богатых областей ДНК.

Структура ДНК

ДНК может формировать несколько типов двойных спиралей. В настоящее время уже известно шесть форм (от А до Е и Z-форма). Большая часть структурных вариантов ДНК может существовать только в строго контролируемых условиях эксперимента. Эти варианты различаются 1) числом пар оснований, приходящихся на один виток двойной спирали; 2) расстоянием между плоскостями пар оснований и углом, который они образуют с осью спирали; 3) диаметром спирали; 4) направленностью (правая, левая) двойной спирали (табл. 37. 1).

Некоторые из этих форм переходят друг в друга при изменении концентрации соли и степени гидратации. Не исключено, что переходы между различными структурными формами ДНК происходят и in vivo.

Рис. 37.2. Модель двухспиральной структуры В-формы по Уотсону и Крику. Слева: Схематическое изображение молекулы (А - аденин, С - цитозин, G - гуанин, Т - тимин, Р - фосфат, S-сахар [дезоксирибоза]). Справа: модель структуры ДНК. (Photograph from J.D. Watson, Molecular biology of the Gene 3rd ed. Copyrght 1976, 1970, 1965 by W. A. Benjamin, Inc., Menlo Park, Calif.)

При физиологических условиях (низкая концентрация соли, высокая степерь гидратации) доминирующим структурным типом ДНК является В-форма. Шаг спирали такой молекулы равен 3,4 нм. Виток ДНК можно представить в виде двух скрученных стопок «монет», по 10 в каждой. Стопки удерживаются водородными связями между двумя противолежащими «монетами» стопок, и «обмотаны» двумя лентами фосфодиэфирного остова, закрученными в правую спираль. В условиях менее высокой гидратации и при более высоком содержании ионов Na+ или К+ возникает несколько иная структура - так называемая A-форма. Эта правоспиральная конформация имеет больший диаметр спирали, чем В-форма, и большее число пар оснований на виток. Она сходна со структурой, характерной для двухцепочечной РНК или для РНК-ДНК-дуплексов. Формы С-Е также правоспиральные, их образование можно наблюдать только в специальных экспериментах, и, по-видимому, они не существуют in vivo.

Z-форма. ДНК представляет собой левозакрученную двойную спираль, в которой фосфодиэфирный остов расположен зигзагообразно вдоль оси молекулы. Отсюда и название молекулы (zigzag)-ДHK. Z-ДНК - наименее скрученная (12 пар оснований на виток) и наиболее тонкая из известных в природе, она обладает только одним желобком (см. ниже). Z-ДНК выявляют в повторяющихся последовательностях чередующихся пуриновых и пиримидиновых дезоксинуклеотидов (GC или АС) при наличии ряда других стабилизирующих факторов. К ним относятся: 1) высокая концентрация соли или наличие специфических катионов, таких, как спермин и спермидин; 2) высокое содержание отрицательных супервитков в молекуле ДНК (см. гл. 38); 3) связывание Z-ДНК-специфичных белков; 4) метилирование атома углерода-5 некоторых остатков дезоксицитидина.

ДНК в Z-форме может участвовать в регуляции экспрессии генов как близко расположенных, так и существенно удаленных от Z-участка. Некоторые белки, связывающиеся в большой или малой бороздках В-формы ДНК, вероятно, не способны связываться с Z-формой ДНК. Кроме того, реверсия участка ДНК из Z-формы в В-форму ДНК, которая происходит, например, в результате потери метальных групп -метилдезоксицитидином. может влиять на торсионный статус участков ДНК, расположенных на значительном расстоянии от области реверсии.

Рис. 37.3. Образование двух водородных связей (пунктирная линия) между основаниями дезоксиаденозина и тими-дина (вверху) и трех водородных связей между основаниями дезоксигуанозина и дезоксицитидина (внизу). В ДНК углеводным остатком является 2-дезоксирибоза, в РНК D-рибоза

Торсионное скручивание-раскручивание ДНК так же, как и метилирование дезоксицитидина, вероятно, влияет на активность генов (см. ниже).

Наличие Z-ДНК в хромосомах Drosophila (плодовая мушка) было показано с применением антител специфичных к Z-форме ДНК. В ДНК человека имеются участки, потенциально способные переходить в Z-форму; они диспергированы в геноме.

Таблица 37.1. Характеристика некоторых типов структур ДНК

Есть основания предполагать, что и в клетках человека могут реализоваться условия, необходимые для стабилизации Z-формы.

Денатурация (плавление) ДНК

Двухспиральную структуру ДНК можно «расплавить» в растворе, повышая температуру или понижая концентрацию соли. При плавлении происходит не только расхождение цепей ДНК, но и нарушается система стэкинг-взаимодействий нуклеиновых оснований внутри данной цепи. Фосфодиэфирные связи при этом не разрываются. Денатурация ДНК сопровождается усилением оптического поглощения пуриновых и пиримидиновых оснований. Это явление называют гиперхромным эффектом денатурации ДНК. При денатурации исчезает также высокая вязкость, присущая растворам нативной ДНК, волоконноподобная структура которой обусловлена как стэкинг-взаимодействиями нуклеиновых оснований в каждой цепи, так и комплементарными взаимодействиями между двумя цепями.

Разделение цепей данной молекулы ДНК происходит в пределах определенного интервала температур. Средняя точка этого интервала называется температурой плавления ДНК или . Значение зависит от нуклеотидного состава ДНК и концентрации соли в растворе. Молекулы ДНК, обогащенные G-С-парами (они связаны тремя водородными мостиками), «плавятся» при более высокой температуре, чем А-Т-богатые молекулы (пары А-Т связаны двумя водородными мостиками). Десятикратное увеличение концентрации моновалентных катионов увеличивает на 16,6° С. Формамид, обычно используемый в экспериментах с рекомбинантной ДНК, дестабилизирует водородные связи между основаниями, тем самым снижая . Это позволяет цепям ДНК или ДНК-РНК-гибрида расходиться при более низкой , что уменьшает вероятность разрыва индивидуальных цепей, происходящего при высокой температуре.

Бороздки в структуре ДНК

При изучении модели, изображенной на рис. 37.2, можно обратить внимание на наличие в структуре ДНК большой и малой бороздок, закрученных вокруг оси молекулы параллельно фосфодиэфирному остову. В этих бороздках белки могут специфически взаимодействовать с определенными атомами нуклеиновых оснований, а значит, и «узнавать» конкретные нуклеотидные последовательности, не нарушая комплементарных взаимодействий в структуре двойной спирали. Как будет показано в гл. 39 и 41, именно за счет таких взаимодействий регуляторные белки могут осуществлять контроль экспрессии генов.

Релаксированная и суперспиральная ДНК

ДНК некоторых организмов, таких, как бактерии, бактериофаги и многие ДНК-содержащие вирусы животных, представляет собой замкнутую кольцевую структуру. Конечно, такая структура не нарушает полярность молекул, но в ней исчезают свободные и -гидроксильные и фосфорильные группы. Замкнутые кольца могут существовать в релаксированной или суперспиральной формах. Суперспиральность проявляется тогда, когда замкнутое кольцо сворачивается вокруг собственной оси или когда скручивается участок линейной ДНК, концы которой зафиксированы. Этот требующий энергии процесс приводит к появлению внутримолекулярного напряжения структуры. При увеличении числа супервитков внутреннее (торсионное) напряжение возрастает (проверьте это на обычной резиновой ленте). Супервитки в ДНК, образованные за счет скручивания против часовой стрелки (в направлении, обратном закручиванию правосторонней двойной спирали В-формы ДНК), называются отрицательными. В некотором смысле можно считать, что энергия, необходимая для достижения такого структурного состояния, запасается в обычных (неотрицательных) супервитках. Энергия перехода молекулы ДНК к другому типу надмолекулярной структуры может понижаться за счет образования участков отрицательного скручивания. Один из таких переходов - разделение цепей при подготовке к репликации и транскрипции. Вот почему суперспирализация ДНК весьма выгодна в биологических системах. Ферменты, катализирующие топологические изменения молекулы ДНК, получили название топоизомераз. Наиболее изучена из них - бактериальная гираза, инициирующая образование отрицательных супервитков.

Функция ДНК

Генетическая информация, закодированная в последовательности нуклеотидов, служит двум целям. Во-первых, она необходима для синтеза белковых молекул, во-вторых, обеспечивает передачу самой себя в ряду клеточных поколений и поколений организмов. Обе функции основаны на том, что молекула ДНК служит матрицей; в первом случае для транскрипции - перекодирования информации в структуру молекул РНК и во втором для репликации - копирования информации в дочерних молекулах ДНК.

Комплементарность цепей двойной спирали Уотсона и Крика предполагает полуконсервативиый способ репликации ДНК. Это означает, что цепи расходятся и каждая служит матрицей для синтеза новой комплементарной последовательности (рис. 37.4). Две образовавшиеся двухспиральные молекулы ДНК, каждая из которых состоит из одной родительской и одной вновь синтезированной комплементарной цепи, распределяются между двумя дочерними клетками (рис. 37.5). Таким образом, каждая из дочерних клеток получает информацию, идентичную той, которой обладала родительская клетка. В каждой из двух дочерних клеток сохраняется одна цепь от исходной родительской ДНК.

Полуконсервативиый механизм репликации у бактерии Escherichia coli был однозначно продемонстрирован в классическом эксперименте Мезелсона и Сталя с применением тяжелого изотопа азота в сочетании с равновесным центрифугированием.

Рис. 37.4. Двухцепочечная структура ДНК. Каждая из двух цепей родительской молекулы ДНК используется в качестве матрицы для синтеза новых комплементарных цепей. (From J. D. Watson. Molecular biology of the Gene 3rd ed. Copyright 1976, 1970, 1965 by W. A. Benjamin, Inc., Menlo Park,

Рис. 37.5. Ожидаемое распределение цепей ДНК при полуконсервативной и консервативной репликациях. На рисунке родительские цепи - черные, а новые цепи - светлые. (Redrawn and reproduced, with permission from Lehninger A. L. Biochemistry 2nd. ed., Worth, 1975.)

ДНК E. coli и ДНК человека химически идентичны, хотя, конечно, последовательности нуклеотидов в них отличаются и, кроме того, клетка человека содержит примерно в 1000 раз больше ДНК, чем бактериальная. Оказалось, что химический механизм репликации ДНК - один и тот же у прокариот, таких, как Е. coli, и эукариот, включая человека, несмотря на то что ферменты, вовлеченные в эти процессы, в клетках прокариот и эукариот различаются. Есть все основания считать, что данные, полученные при изучении химии нуклеиновых кислот прокариотических организмов, приложимы и к эукариотическим системам. Действительно, результаты экспериментов с клетками млекопитающих, аналогичных опытам Мезелсона и Сталя, оказались сопоставимыми с данными, полученными ранее на Е. coli.

Если медленно нагревать растворы вирусной или бактериальной ДНК, то их молекулы денатурируют при вполне определенных температурах (рис. 27-16). Переход от нативного дуплекса ДНК к расплетенной беспорядочно скрученной денатурированной форме можно обнаружить по увеличению поглощения ультрафиолетового света или по уменьшению вязкости раствора ДНК. Для каждого вида ДНК характерна своя температура денатурации, называемая «точкой плавления». Чем выше содержание в ДНК пар G=C, тем выше точка плавления этой ДНК. Это объясняется тем, что пары GC более стабильны и на их диссоциацию требуется больше энергии, чем на разрушение пар А=Т; отчасти это обусловлено тем, что пары G=C соединены тремя водородными связями, а пары А=Т - лишь двумя.

Тщательное определение точки плавления препарата ДНК при фиксированных условиях pH и ионной силы может дать, следовательно, информацию о соотношении пар А=Т и G=C в ДНК.

Второе физическое свойство ДНК, обусловленное соотношением пар G=C и А=Т, это плавучая плотность. Препарат ДНК с более высоким содержанием G=C-nap обладает чуть большей плотностью, чем ДНК с повышенным содержанием А=Т-пар. Препараты ДНК центрифугируют при высоких скоростях в концентрированном растворе хлористого цезия (), плотность которого лежит в том же диапазоне, что и плотность ДНК.

Рис. 27-15. Принцип гибрилизационного теста. Два препарата ДНК, выделенной из организмов разных видов нагревают так, что они полностью денатурируют и их цепи расходятся. При смешивании этих препаратов и медленном охлаждении комплементарные цепи ДНК каждого вида найдут друг друга и будут ренатурировать с образованием нормальных дуплексов. Если между двумя ДНК существует значительная гомология по последовательности, то возможно образование гибридных молекул, представляющих собой частичные дуплексы. Чем выше степень гомологии, тем больше вероятность образования гибридов. Содержание гибридов в смеси можно измерить разными способами, в частности с помощью хроматографии или центрифугирования в градиенте плотности. Обычно, чтобы упростить процедуру измерения, одну из ДНК метят радиоактивным изотопом

Рис. 27-16. Кривая денатурации (плавления) двух препаратов ДНК. Температура, соответствующая средней точке перехода называется точкой плавления. Поскольку величина зависит от pH и концентрации соли, всегда надо конкретизировать условия ее измерения.

При центрифугировании в центрифужной пробирке формируется градиент плотности с наибольшей плотностью у дна пробирки. Если поместить в нее ДНК, то она сначала будет перемещаться по направлению ко дну пробирки, но затем в определенном положении остановится и будет держаться на плаву. В этом положении она не может ни всплыть, ни осесть, поскольку плотность раствора здесь равна ее плотности. С помощью этого метода, более подробно описанного в гл. 28, можно отделить друг от друга молекулы ДНК, различающиеся по содержанию G=С-пар, поскольку они обладают разной плавучей плотностью. Исходя из плавучей плотности данной ДНК, можно подсчитать соотношение в ней пар G=С и А=Т.

Гибридизация ДНК

Гибридизация ДНК , гибридизация нуклеиновых кислот - соединение in vitro комплементарных одноцепочечных нуклеиновых кислот в одну молекулу. При полной комплементарности объединение происходит легко и быстро, а в случае частичной некомплементарности слияние цепочек замедляется, что позволяет оценить степень комплементарности. Возможна гибридизация ДНК-ДНК и ДНК-РНК.

Протокол эксперимента

Двухцепочечную ДНК разогревают в соответствующем буфере . Из-за изменения внешних условий, водородные связи между комплементарными азотистыми основаниями становятся термодинамически невыгодными и цепочки расходятся.
Препарат денатурированных ДНК смешивают с другой денатурированной ДНК.
Препараты медленно охлаждают, при этом одноцепочечные ДНК отжигаются друг на друга (образуются водородные связи между комплементарными основаниями), при этом образуется «гибридная» молекула ДНК.

Анализ скорости отжига одноцепочечных ДНК позволяет оценивать сходства и различия в последовательностях ДНК между видами или особями одного вида.

Вычисление температуры плавления ДНК

Вторичная структура ДНК играет важную роль в биологии, генетической диагностики и других методов молекулярной биологии и нанотехнологии. Поэтому, точное определение температуры плавления ДНК или РНК молекул играет самую главную роль во всех молекулярно-биологических методах, например, как подбор проб или олигонуклеотидов для микрочипов или для подбора ПЦР праймеров . Существует несколько простых формул вычисления температуры плавления для коротких олигонуклеотидов. Грубое вычисление температуры плавления (T m) короткого олигонуклеотида (<20 нуклеотидов) проводят по прямому подсчету количества нуклеотидов (G+C - сумма всех гуанинов и цитозинов , L - длина олигонуклеотида):

Усредненная формула подсчета T m для короткого олигонуклеотида (и для длинных ДНК фрагментов), с учетом концентрации ионов K + и DMSO :

Однако, эти уравнения не учитывают инициацию связывания при гибридизации олигинуклеотида, не учитывают особенности самой последовательности и концевого эффекта, характерный для олигонуклеотидных дуплексов. Поэтому, данная формула пригодна в большей степени, где последовательность ДНК усредненная и длина дуплексов свыше 40 нуклеотидов.

ДНК термодинамика

Наиболее распространенный метод используемый сегодня для расчета температуры плавления двухцепочечной или одноцепочечной ДНК, основан на двух ступенчатой термодинамической модели. Две комплементарные ДНК молекулы А и В, либо они связаны друг с другом либо свободны в растворе («random coil state»). Обычно считается, что обе молекулы А и В полностью комплементарны, поэтому очевидна их гибридизация, а также разрешены одна или несколько ошибок комплементарности в дуплекс, в том числе допустимы и некомплементарные G-G, G-T и G-A пары (wobble pairs). В случае же только одной молекулу, предполагается упаковка ее в петлевую структуру. Процесс гибридизации в дуплекс описывается формулой:

где А и В разные цепи в растворе («random coil state»), и АВ образованный дуплекс. Данная реакция обратима. Константа равновесия k , для этой реакции определяется как: .

Константа равновесия зависит от концентрации цепей, от температуры, концентрации солей, рН и других компонентов в реакции (например, глицерин или DMSO). Константа К меняется в ответ на изменение концентрации одной или обоих цепей ( и/или ), тогда вся система отвечает на изменения и тогда индивидуальные концентрации [A], [B] и тоже изменятся. Например, если в системе больше цепи А, то концентрация увеличится. Предположим, константа равновесия равна 1.81x10 6 и концентрация цепей = = 10 -5 M:

Подставляем компоненты в формулы для вычисления k:

После перестановки получаем:

Например, подставить в эту формулу = 7.91x10 -6 M тогда концентрацию цепей составит [A] = [B] = 2.09x10 -6 M. То есть только 79% цепей будет связаны в дуплекс .

Возможно ли определить константы равновесия при изменении температуры? Это подводит нас к пониманию важных термодинамическим параметрам как свободной энергии (dG), энтальпия (dH) и энтропия (dS). Изменения свободной энергии, энтальпия и энтропия происходят при переходе от «температуре Т гибридизации» к беспорядочному, случайному состоянию. Эти отношения определяются формулой dG = dH – TdS , (для концентрации цепей [A] = [B] = = 1M), тогда идеальная формула для вычисления свободной энергии Гиббса:

где T температура в кельвинах, dH° (cal/mol) и dS° (cal/mol K).

Существует полезное соотношение, связывающее изменение свободной энергии Гиббса в ходе химической реакции с её константой равновесия:

где R – универсальная газовая постоянная (1.987cal/mol K).

Комбинируя обе формулы получаем:

Температура плавления (T m) определяется при равновесии, когда половину цепей связаны друг с другом и другая половина находится в свободном состоянии, то есть k=1:

Температуру плавления для простой петли рассчитывают как . Для ДНК дуплекса необходимо учитывать концентрацию каждой цепи (в молях, М). Таким образом, если [A] и [B] концентрации молекул А и В, то общая концентрация цепей, C равна их сумме, [A] + [B].

Предполагается, что концентрация обоих цепей одинаковая [A] = [B] = C/2. В таком случае,

где f = 4. Для самокомплементарного олигонуклеотида = C и тогда и f = 1. Данная температура плавления определяется только в случае, когда половина молекул связаны друг с другом.

Для самокомплементарного олигонуклеотида, k = 1/ поэтому:

Для не комплементарного дуплекса, когда ≥ , k =1/( – /2), Tm вычисляют так:

где молярная концентрация преобладающей цепи (как правило ПЦР праймер), а [Вt] молярная концентрация цепи с низкой концентрацией (геномная ДНК).

Вычисление температуры плавления

Термодинамические параметры dG, dH и dS рассчитываются на основе модели ближайших соседей (nearest neighbour). Для точного прогнозирования вторичной структуры ДНК при гибридизации с использованием динамических алгоритмов программирования требуется база данных по всем возможным термодинамическим параметрам для каждой комплементарной пары оснований, а также для для всех вариантов при не совпадающих нуклеотидов, для свободных концов, шпилек и петель. Термодинамическая формула вычисления короткого олигонуклеотида основывается на термодинамических параметрах - энтропии dS и энтальпии dH, для каждой из 10 вариантов сочетаний четырех нуклеотидов (Таблица 1). В Таблице 1 представлены термодинамические параметры для ближайших соседей (NN) для пар нуклеотидов при концентрации 1М NaCl.

Для подсчета Tm (°С) осуществляется суммирование всех значений свободной энергии Гиббса для каждой пары с шагом один нуклеотид:

dG общая = dG начальное + dG симетрия +∑dG + dG AT конец

dG теоретическая = 1.96 + 0 - 2.17 – 1.44 – 1.44 – 1.00 – 1.45 – 1.30 +0.05

dG теоретическая = -5.35 kcal/mol

Аналогично подсчитываются значения энтропии (dH = -43.5 kcal/mol) и энтальпии (dS = -122.5):

Многие ДНК дуплексы имеют конкурирующие однонитевые структуры, и это сдвигает равновесии системы и как результат снижение значения T m от предсказуемой формулой значения.

Общая формула для вычисления T m с коррекцией на соль в растворе:

где L - длина олигонуклеотида, R - газовая постоянная (1.987cal/K mol), c - концентрация олигонуклеотида в (обычно 2x10 −7 M), - концентрация ионов калия в молях (обычно 5x10 −2 M).

Таблица 1. Термодинамические параметры для ближайщих соседей (NN) для пар нуклеотидов при концентрации 1М NaCl ,

Последовательность пар (5"-3"/3"-5")	° kcal/mol	° cal/(mol·K)	° 37 kcal/mol
AA/TT	-7.6	-21.3	-1.00
AT/TA	-7.2	-20.4	-0.88
TA/AT	-7.2	-20.3	-0.58
CA/GT	-8.5	-22.7	-1.45
GT/CA	-8.4	-22.4	-1.44
CT/GA	-7.8	-21.0	-1.28
GA/CT	-8.2	-22.2	-1.30
CG/GC	-10.6	-27.2	-2.17
GC/CG	-9.8	-24.4	-2.24
GG/CC	-8.0	-19.9	-1.84
инициация	+0.2	-5.7	+1.96
концевая A-T пара	+2.2	+6.9	+0.05
коррекция на симметрию	0.0	-1.4	+0.43

Одиночная ошибка внутри дуплекса

Модель ближайших соседей для комплементарных нуклеотидных пар может расширен для пары, включающие некомплементарные нуклеотиды. Было показано, что существует тенденция уменьшающая стабильность не комплементарных пар оснований в порядке убывания:

G-C > A-T > G·G > G·T ≥ G·A > T·T ≥ A·A > T·C ≥ A·C ≥ C·C

Гуанидин G является наиболее «неразборчивым» основанием, поскольку он образует сильный пары оснований и с некомплементарными основаниями (G·G, G·T и G·A). С другой стороны, цитозин C является наиболее дискриминационным основанием, поскольку он образует самые стабильные комплементарные пары и неустойчивые пары с некомплементарными основаниями (T·C ≥ A·C ≥ C·C) , .