Λιώσιμο DNA. Φυσικές και χημικές ιδιότητες του DNA Χαλαρό και υπερτυλιγμένο DNA

Φυσικές και χημικές ιδιότητες του DNA

Όνομα παραμέτρου	Εννοια
Θέμα άρθρου:	Φυσικές και χημικές ιδιότητες του DNA
Ρουμπρίκα (θεματική κατηγορία)	Αθλημα

1. Μετουσίωσης

Η μετουσίωση του DNA πραγματοποιείται υπό τη δράση χημικών παραγόντων (ουρία, χλωριούχο γουανιδίνη, οξύ, αλκάλιο) και φυσικών παραγόντων (θερμοκρασία). Ως αποτέλεσμα της μετουσίωσης, η δευτερογενής δομή του DNA καταστρέφεται. Όταν αφαιρεθεί η επίδραση του μετουσιωτικού παράγοντα, η δευτερογενής δομή του DNA πρέπει να αποκατασταθεί. Αυτή η διαδικασία ονομάζεται renaturation.

Η μετουσίωση ή η τήξη του DNA συνοδεύεται από αύξηση της οπτικής πυκνότητας των διαλυμάτων DNA σε μήκος κύματος 260 nm. Αυτό το φαινόμενο ονομάζεται υπερχρωμικό φαινόμενο. Η μέγιστη αύξηση στην οπτική πυκνότητα ενός διαλύματος DNA κατά την πλήρη διάσπασή του σε μονονουκλεοτίδια στο καθορισμένο μήκος κύματος είναι περίπου 80%.

Ένα μόριο DNA που αποτελείται μόνο από poly-d(AT) τήκεται σε χαμηλότερες θερμοκρασίες από ένα μόριο DNA που αποτελείται από poly-d(GC). Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι σχηματίζονται δύο δεσμοί υδρογόνου μεταξύ Α και Τ και τρεις δεσμοί υδρογόνου μεταξύ G και C.

2. Σημείο τήξης

Το πιο σημαντικό χαρακτηριστικό του DNA είναι η θερμοκρασία τήξης του, η οποία αντιστοιχεί στη θερμοκρασία στην οποία η αύξηση της οπτικής πυκνότητας ενός διαλύματος DNA είναι ίση με το ήμισυ της μέγιστης αύξησης που παρατηρείται κατά την πλήρη μετουσίωσή του DNA. Η θερμοκρασία τήξης του DNA που αποτελείται από poly-d(AT) είναι 66 o C, το DNA που αποτελείται από poly-d(GC) είναι 85 o C. Το φυσικό DNA έχει σημείο τήξης μεγαλύτερο από 66 o C, αλλά μικρότερο από 85 o Γ, γιατί περιλαμβάνουν και τις τέσσερις αζωτούχες βάσεις, αλλά σε διαφορετικές αναλογίες σε διαφορετικούς ζωντανούς οργανισμούς. Έτσι το ανθρώπινο DNA χαρακτηρίζεται από σημείο τήξης ίσο με 81 - 82 o C, E. coli - 90,5 o C.

Όταν το διάλυμα DNA ψύχεται (ανοπτείται), η αρχική δευτερογενής δομή του DNA μπορεί να αποκατασταθεί σύμφωνα με την αρχή της συμπληρωματικότητας.

3. Υβριδισμός

Εάν ένα μείγμα διαφορετικών μορίων DNA αρχικά λιώσει και στη συνέχεια ανόπτεται, τότε εάν υπάρχει ομοιότητα στις πρωτογενείς δομές τους, είναι δυνατός ο υβριδισμός μεταξύ των μορίων DNA.

Εικόνα - Υβριδισμός μεταξύ διαφορετικών μορίων DNA

Όσο μεγαλύτερη είναι η ομοιότητα μεταξύ των μορίων του DNA, τόσο υψηλότερος είναι ο βαθμός υβριδοποίησης. Με βάση τα αποτελέσματα του υβριδισμού μεταξύ του DNA διαφορετικών ειδών ζωντανών οργανισμών, μπορεί κανείς να κρίνει τη σχέση τους. Όσο υψηλότερος είναι ο βαθμός υβριδισμού, τόσο στενότερη είναι η σχέση μεταξύ των αναλυόμενων ειδών.

Ο υβριδισμός είναι επίσης δυνατός μεταξύ μορίων DNA και RNA, με την προϋπόθεση ότι υπάρχουν ομόλογες αλληλουχίες νουκλεοτιδίων.

Εικόνα - Υβριδισμός μεταξύ DNA και RNA

4. Τα νουκλεϊκά οξέα απορροφούν έντονα το υπεριώδες φως, και αυτή η ιδιότητα αποτελεί τη βάση του προσδιορισμού της συγκέντρωσής τους. Η μεταλλαξιογόνος επίδραση του υπεριώδους φωτός συνδέεται επίσης με την ίδια ιδιότητα.

οργάνωση ευκαρυωτικού DNA

Το μήκος του μορίου του ευκαρυωτικού DNA είναι πολλές φορές μεγαλύτερο από το μέγεθος του κυττάρου. Για να εξασφαλιστεί η ροή διαφόρων βιολογικών διεργασιών, πρέπει να είναι κατάλληλα συσκευασμένο. Υπάρχουν πολλά επίπεδα συμπίεσης του.

1. Γυμνό DNA - είναι διπλή έλικα, η διάμετρός της είναι 1,8 nm˸

Αυτό το DNA είναι υπερευαίσθητο στις DNases, ένζυμα που υδρολύουν τους φωσφοδιεστερικούς δεσμούς.

Φυσικές και χημικές ιδιότητες του DNA - έννοια και τύποι. Ταξινόμηση και χαρακτηριστικά της κατηγορίας «Φυσικές και χημικές ιδιότητες του DNA» 2015, 2017-2018.

Δομή του DNA
μορφές DNA
νουκλεοτιδική σύνθεση του DNA
Λιώσιμο DNA
τοπολογία του DNA
Το DNA είναι ένα μόριο που αποτελείται από δύο αντιπαράλληλα μόρια που συνδέονται με δεσμούς υδρογόνου σύμφωνα με την αρχή της συμπληρωματικότητας με το σχηματισμό μιας ελικοειδής δομής.

Δομή του DNA

Η δομική μονάδα της αλυσίδας του DNA είναι ο δεοξυριβονουκλεοσίδης, που αποτελείται από φωσφορικό άλας, σάκχαρο δεοξυριβόζης και τέσσερα νουκλεοτίδια: αδενίνη (Α), κυτοσίνη (C), γουανίνη (G) και θυμίνη (Τ). Σε ορισμένους φάγους, η θυμίνη αντικαθίσταται από την Ουρακίλη (φάγος PBS1), η οποία συνήθως περιλαμβάνεται στο RNA. Τα νουκλεοτίδια δύο κλώνων DNA συνδέονται με δεσμούς υδρογόνου σύμφωνα με την αρχή της συμπληρωματικότητας: πουρίνες A-T, G-C (2 δακτύλιοι) -Αδενίνη, Πυριμιδίνες Γουανίνης -Θυμίνη, Κυτοσίνη |
dDNA=20A; - για την πουρίνη-12Α, για την πυριμιδίνη-8Α |
Στο ζεύγος A-T υπάρχουν 2 δεσμοί H, στο ζεύγος G-C υπάρχουν 3 |
Περιστρεφόμενο μόριο DNA
Βασικός ταυτομερισμός
Στους ετερόκυκλους, τα πρωτόνια που συνδέονται με το άζωτο μπορούν να περάσουν
σε άλλα άτομα αζώτου ή σε άτομα οξυγόνου της κετοομάδας, και σε διαλύματα θα υπάρχει μια ισορροπία διαφόρων ταυτομερών δομών που μετασχηματίζονται γρήγορα μεταξύ τους.
Ως αποτέλεσμα ταυτομερών μετασχηματισμών, τα U και G σε μορφή ενόλης μπορούν να μιμηθούν τα C και A κατά τη διάρκεια του ζευγαρώματος, ενώ τα C και A στην ιμινο μορφή μπορούν να μιμηθούν τα U και G, τα οποία μπορούν να οδηγήσουν σε μεταλλάξεις στο DNA (Εικ.).
Αλληλεπίδραση πονταρίσματος
Οι βάσεις στην αλυσίδα του DNA βρίσκονται η μία πάνω στην άλλη σε μια στοίβα, η οποία παρέχει πρόσθετη σταθεροποίηση της αλληλεπίδρασης αλυσίδας - στοίβαξης.
Η αξία της αλληλεπίδρασης στοίβαξης μεταξύ βάσεων: πουρίνη-πουρίνη>πυριμιδίνη-πουρίνη>πυριμιδίνη-πυριμιδίνη
Στα ολιγο- και πολυνουκλεοτίδια, η στοίβαξη μεταξύ γειτονικών βάσεων οδηγεί στο σχηματισμό μιας σταθερής μονόκλωνης ελικοειδής δομής (polyA), ενώ η απουσία στοίβαξης οδηγεί σε ένα διαταραγμένο πηνίο (polyU).
Ενέργεια αλληλεπιδράσεων στοίβαξης ~ -3 - -15 kcal/mol
Η ραχοκοκαλιά σακχάρου-φωσφορικού έξω από τη βάση εντός των φωσφορικών δεοξυροβόζης συνδέονται με φωσφοδιεστερικούς δεσμούς. Οι ομάδες ΟΗ του φωσφορικού άλατος συνδέονται
με μια ομάδα ΟΗ στους άνθρακες 3" και 5" της δεοξυριβόζης.
Αναντιστοιχία μπορεί να συμβεί όταν η θυμίνη είναι σε μορφή ενόλης ή η κυτοσίνη σε ιμινο μορφή.

Τροποποιήσεις Νουκλεοτιδίων

εικ.1 Τροποποιημένα νουκλεοτίδια[Τραγουδιστής].

Τα νουκλεοτίδια στο DNA μπορούν να υποστούν τροποποιήσεις: 5-μεθυλοκυτοσίνη,
5-υδροξυμεθυλοκυτοσίνη, 5-υδροξυμεθυλουρακίλη,
Ν-μεθυλαδενίνη. Στο DNA ορισμένων βακτηριοφάγων, μονο- ή δισακχαρίτες συνδέονται με την υδροξυμεθυλ ομάδα της υδροξυμεθυλκυτοσίνης μέσω ενός γλυκοσιδικού δεσμού. Το DNA των περισσότερων κατώτερων ευκαρυωτών και ασπόνδυλων περιέχει σχετικά λίγη 5-μεθυλκυτοσίνη και
Ν6-μεθυλαδενίνη. Στα σπονδυλωτά παίζει η μεθυλίωση της βάσης
σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης, με την 5-μεθυλκυτοσίνη να είναι η πιο κοινή. Δείχνεται, αυτό
περισσότερο από το 95% των μεθυλομάδων στο DNA των σπονδυλωτών περιέχονται στα υπολείμματα κυτοσίνης των σπάνιων δινουκλεοτιδίων CG και περισσότερο από το 50% αυτών των δινουκλεοτιδίων είναι μεθυλιωμένα. Στα φυτά, η 5-μεθυλκυτοσίνη μπορεί να βρεθεί στα δινουκλεοτίδια CG
και τρινουκλεοτίδια CNG (N – C, A ή T).

Μορφές DNA

Επιλογές	σχήμα Β	Ενα σχήμα	Σχήμα C	σχήμα Ζ
σπειροειδής	δεξιόχειρας	δεξιόχειρας	δεξιόχειρας	αριστερόχειρας
μονάδες επαναλαμβάνω	Δευτ. 1	1 μηνός	1 μηνός	2 μην
mon σε κυκλοφορία	10,4	10,7	9.3	12
διάμετρος	23,7Α	25,5Α		18.4Α
περιστροφής/μον	35,9	33,6	38,7	60/2
κλίση του μην προς τον άξονα	-1,2	+19		-9
rast. m-y mon κατά μήκος του άξονα	0,332 nm	0,23 nm		0,38 nm
μήκος στροφής	34Α	28Α	31Α	34,4Α

Στη μελέτη του DNA με διάφορες μεθόδους, διαπιστώθηκε η παρουσία διαφόρων μορφών DNA που σχηματίζονται κάτω από διάφορες συνθήκες (συγκέντρωση αλατιού, υγρασία), μερικές από τις οποίες είναι σε θέση να υπάρχουν σε ζωντανούς οργανισμούς.

Υπάρχουν A, B, C, D, T-οικογένειες μορφών DNA, οι οποίες μπορούν να υποδιαιρεθούν σε διαφορετικούς υποτύπους (C, C"").
Β-DNA- η βασική κατάσταση του DNA που εμφανίζεται στους κρυστάλλους και στα υδατικά διαλύματα.
C-DNA- η μορφή που υπάρχει σε μειωμένη συγκέντρωση Na και υγρασία 44-66%, αν GC=31-72%.
Α-DNA- αυτή η μορφή σχηματίζεται σε υβρίδια DNA-RNA, επομένως, κατά τη μεταγραφή, το DNA περνά στη μορφή Α, στη θέση επαφής RNA-pol. Αυτό το σχήμα χαρακτηρίζεται από την παρουσία ενός εσωτερικού κενού με διάμετρο 5Α.

Z-DNA- αριστερόστροφη μορφή Η μετάβαση Β-->Ζ διευκολύνεται από την παρουσία της αλληλουχίας GC-5", η οποία είναι η θέση μεθυλίωσης στους οργανισμούς. Τέτοιες αλληλουχίες στα πλασμίδια κατά τη διάρκεια της υπερέλιξης αλλάζουν από το Β στο Ζ.
Στη μετάβαση B-->Z, το τμήμα των 11 bp έχει μια μεταβατική μορφή μεταξύ της αριστερής και της δεξιάς έλικας.
Το Z-DNA βρέθηκε σε διαζώνες πολυτενικών χρωμοσωμάτων του D. melanogaster.

Το πολυνουκλεοτίδιο GC-5", όντας σε μορφή Β, σχηματίζει νουκλεοσώματα σε χαμηλές συγκεντρώσεις άλατος. Σε υψηλές συγκεντρώσεις άλατος, το πολυνουκλεοτίδιο GC-5" περνά στη μορφή Ζ, η οποία δεν σχηματίζει νουκλεοσώματα.
Οι μορφές Α-, Ζ δεν μπορούν να υπάρχουν σε ένα υδατικό διάλυμα χωρίς πρόσθετες επιδράσεις (πρωτεΐνες, υπερέλιξη).

D-DNA- Πλούσιες σε ΑΤ περιοχές DNA φάγων Τ2, στις οποίες η κυτοσίνη αντικαθίσταται από 5"-υδροξυμεθυλκυτοσίνη, το μόνο γνωστό φυσικό DNA είναι σε μορφή D. Επιπλέον, το DNA του φάγου γλυκοζυλιώνεται περισσότερο από 70%.
Η διπλή έλικα του D-DNA είναι πιο στριμμένη από το B-DNA και έχει μια βαθιά μικρή αυλάκωση - μια βολική κοιλότητα για νερό και κατιόντα.

3D δομές DNA

Καμπυλότητα DNA

Νουκλεοτιδική σύνθεση του DNA

Κανόνες Chargaf
Η νουκλεοτιδική σύνθεση του DNA ορισμένων
οργανισμών[Τραγουδιστής].

Μια πηγή	ΚΑΙ	σολ	ντο	Τ	A+T/G+C	A+G/T+C	G+C, mol.%
Βακτηριοφάγος λ Βακτηριοφάγος Τ2 Escherichia coli Bacillus subtilis Ιός θηλώματος Shoup Saccharomyces cerevisiae Χλαμυδομόνας Νεοσσός Ποντίκι Αγελάδα Σιτάρι	26,0 32,5 23,8 29,0 26,6 31,3 19,6 27,9 28,9 27,3 27,2	23,8 18,2 26,0 20,7 24,5 18,7 30,2 21,2 21,1 22,5 22,6	24,3 16,72 26,4 21,3 24,2 17,1 30,0 21,5 20,3 22,5 22,8	25,8 32,6 23,8 29,0 24,7 32,9 19,7 29,4 30,0 27,7 27,4	1,08 1,86 0,91 1,38 1,05 1,79 0,65** 1,34** 1,44** 1,22** 1,20**	0,99 1,03* 0,99 0,99 1,04 1,00 0,99** 0,96** 1,00** 0,99** 0,99**	48 35* 52 42 49 36 60** 43** 41** 44** 45**

* 5-υδροξυμεθυλοκυτοσίνη
** συμπεριλαμβανομένης της 5-μεθυλκυτοσίνης

Στους ευκαρυώτες, η συχνότητα εμφάνισης του 5"-CG-3" είναι υψηλότερη από αυτή του 5"-GC-3", επειδή Το δινουκλεοτίδιο 5"-GC-3" υφίσταται μεθυλίωση που εμπλέκεται στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης. Στους προκαρυώτες, η αναλογία 5'-CG-3'/5'-GC-3' είναι σχεδόν τυχαία (βλ. πίνακα).

Μέγεθος μορίων DNA

Το μέγεθος του DNA εκφράζεται σε ζεύγη βάσεων (bp) ή χιλιάδες ζεύγη βάσεων (bp)

Μια πηγή	Μ, ναι	Μήκος	Δευτ	Τύπος δομής
Βακτηριοφάγος φX174 SV40 Βακτηριοφάγος Τ2 Χρωμόσωμα του Hemophilus influenzas Χρωμόσωμα Escherichia coli Saccharomyces cerevisiae Χρωμόσωμα 1 Χρωμόσωμα 12 Drosophila melanogaster Χρωμόσωμα 2 Χρωμόσωμα 3 Χρωμόσωμα 4	1,6 10 6 3,5 10 6 1,2 10 8 7,9 10 8 2,6 10 8 1,4 10 8 1,5 10 9 4 10 10 4,2 10 10 4 10 9	1,6 μm 1,1 μm 50 μm 300 μm 1 mm 50 μm 500 μm 15 χλστ 16 χλστ 1,5 χλστ	5 10 3 5,2 10 3 2 10 5 1,2 10 6 4 10 6 2,1 10 5 2,2 10 6 6,0 10 7 6,3 10 7 6 10 6	Κυκλικό μονόκλωνο Κυκλικό διπλό σκέλος Γραμμικό διπλό σκέλος άγνωστος Κυκλικό διπλό σκέλος Γραμμικό διπλό σκέλος Γραμμικό διπλό σκέλος Γραμμικό διπλό σκέλος Γραμμικό διπλό σκέλος Γραμμικό διπλό σκέλος

Λιώσιμο DNA

Μετουσίωσηςή τήξη- απόκλιση των κλώνων του DNA όταν το DNA θερμαίνεται στους ~1000 C ή όταν το pH αυξάνεται.
Η απόκλιση των αλυσίδων συμβαίνει λόγω της καταστροφής του ασθενούς υδρογόνου
δεσμούς και επίπεδες αλληλεπιδράσεις μεταξύ βάσεων.
Η μετουσίωση επηρεάζεται επίσης από: ιόντα μονο- και δισθενών μετάλλων, πρωτεΐνες που εξουδετερώνουν τα αρνητικά φορτία των φωσφορικών ομάδων.
Το σημείο τήξης του GC είναι υψηλότερο από το AT. Για να σπάσει δύο δεσμούς Η ζευγών ΑΤ, απαιτείται λιγότερη ενέργεια από ό,τι για να σπάσει τρεις δεσμούς Η ζευγών GC· η θερμοκρασία και οι τιμές pH στις οποίες συμβαίνει η μετουσίωση εξαρτώνται από τη νουκλεοτιδική σύνθεση του DNA.
Καμπύλη τήξης DNA
Η μετουσίωση είναι μια αναστρέψιμη διαδικασία, η επακόλουθη αποκατάσταση της δομής του δίκλωνου DNA μπορεί να συμβεί ακόμη και με πλήρη απόκλιση των αλυσίδων. Η διαδικασία επανένωσης, που ονομάζεται επανασύνδεση, επανασύνδεση ή ανόπτηση, συμβαίνει όταν
πτώση της θερμοκρασίας ή του pH
Με μια απότομη μείωση της θερμοκρασίας ή του pH, η σωστή επανένωση των συμπληρωματικών αλυσίδων είναι δύσκολη λόγω του ζευγαρώματος.
βάσεις τοπικά συμπληρωματικών περιοχών εντός της ίδιας ή διαφορετικής αλυσίδας.

Η επαναδιάταξη του DNA συμβαίνει σε θερμοκρασία ~200C κάτω από το σημείο τήξης.
Κατά τη διάρκεια της επαναφοράς, τα τμήματα της αλυσίδας με επαναλαμβανόμενο DNA συνδέονται πρώτα και στη συνέχεια με μοναδικά τμήματα.
Καμπύλη επανασύνθεσης DNA
t λιώσει έναντι συμπ. άλας

Ιδιότητες DNA

Ο υπέρηχος κόβει το DNA σε ίσα θραύσματα μήκους ~500 bp.
Το DNA είναι αδιάλυτο σε μη πολικούς διαλύτες.
Το αλκάλι υδρολύει το DNA.
Λόγω του φορτίου των φωσφορικών ομάδων, το DNA έχει αρνητικό φορτίο.

Τοπολογία μορίων DNA

Λογοτεχνία:

1. Τραγουδιστής: Genes and genomes v.1
2. Zenger.V: Αρχές δομικής οργάνωσης νουκλεϊκών οξέων. Μ., Μιρ, 1987

Το 1944, πειράματα από τους Avery, McLeod και McCarthy έδειξαν ότι η ικανότητα σχηματισμού κάψουλας σε ένα μεταλλαγμένο ακαψιδιακό στέλεχος πνευμονιόκοκκου θα μπορούσε να αποκατασταθεί με την εισαγωγή στα κύτταρά του καθαρού πνευμονιόκοκκου DNA ικανού να παράγει μια κάψουλα. Οι συγγραφείς ονόμασαν τον παράγοντα (DNA) που είναι υπεύθυνος για αυτή την αλλαγή «παράγοντα μετασχηματισμού». Πολύ σύντομα, η μέθοδος μετασχηματισμού άρχισε να χρησιμοποιείται ευρέως στη γενετική έρευνα. Σχετικά πρόσφατα, πραγματοποιήθηκαν πειράματα στα οποία κύτταρα ζυμομύκητα, κύτταρα θηλαστικών, έμβρυα τρωκτικών και εντόμων χρησίμευαν ως δέκτες και το κλωνοποιημένο DNA χρησίμευσε ως δότης γενετικών πληροφοριών.

Χημικές ιδιότητες του DNA

Η χημική φύση των μονομερών μονάδων που σχηματίζουν το DNA (δεοξυαδενυλικό, δεοξυκυτιδυλικό, δεοξυγουανυλικό και θυμιδυλικό) περιγράφεται στο Κεφ. 34. Τα μονομερή πολυμερίζονται με το σχηματισμό 3, 5-φωσφοδιεστερικών δεσμών, σχηματίζοντας μια μονή αλυσίδα DNA (Εικ. 37. 1). Οι πληροφορίες στο DNA γράφονται με τη μορφή μιας συγκεκριμένης αλληλουχίας δεοξυριβονουκλεοτιδίων πουρίνης και πυριμιδίνης.

Το πολυμερικό μόριο DNA, όπως φαίνεται από το σχήμα, είναι πολικό. Στο ένα άκρο είναι 5-υδροξυλ - (ή φωσφορική ομάδα), στο άλλο 3-φωσφορικό - (ή υδροξυλική ομάδα). Με βάση τα δεδομένα της ανάλυσης περίθλασης ακτίνων Χ του DNA και τον κανόνα Chargaff, σύμφωνα με τον οποίο η περιεκτικότητα σε υπολείμματα δεοξυαδενοσίνης (Α) σε ένα μόριο DNA είναι ίση με την περιεκτικότητα σε θυμιδίνη (Τ) και η περιεκτικότητα σε δεοξυγουανοσίνη (G ) είναι ίσο με την περιεκτικότητα σε δεοξυκυτοσίνη (C), των Watson, Crick και Wilkins που προτάθηκαν στην αρχή του 50-s μοντέλου της δίκλωνης δομής του DNA. Το μοντέλο της Β-μορφής του DNA φαίνεται στο Σχ. 37.2. Οι δύο αλυσίδες αυτού του δεξιόστροφου, δίκλωνου μορίου συγκρατούνται μεταξύ τους με δεσμούς υδρογόνου που σχηματίζονται μεταξύ των βάσεων πουρίνης και πυριμιδίνης. Ο σχηματισμός συμπληρωματικών ζευγών είναι αυστηρά συγκεκριμένος. Ο Α ζευγαρώνει πάντα με (Εικ. 37. 3).

Σε ένα δίκλωνο μόριο, περιορισμοί λόγω της αναστολής της περιστροφής γύρω από τον φωσφοδιεστερικό δεσμό, η κυρίαρχη "αυτόματη διαμόρφωση των γλυκοσιδικών δεσμών (Εικ. 34.9) και οι επικρατούσες ταυτομερείς μορφές των τεσσάρων βάσεων (A, G, T και C , Εικ. 34.3) δημιουργούν συνθήκες στις οποίες το A μπορεί να σχηματίσει ένα ισχυρό ζεύγος μόνο με το T, και το G μόνο με το C (Εικ. 37.3). Αυτό εξηγεί τους κανόνες Chargaff (A = T, G = C). Οι δύο κλώνοι της διπλής έλικας, όντας πολικοί, είναι και

Ρύζι. 37.1. Ένα θραύσμα της δομής ενός μορίου DNA στο οποίο οι βάσεις πουρίνης και πυριμιδίνης αδενίνη (Α), θυμίνη (Τ), κυτοσίνη (C) και γουανίνη (G) συγκρατούνται μεταξύ τους από έναν φωσφοδιεστερικό σκελετό που συνδέει υπολείμματα δεοξυριβοσυλίου που συνδέονται με ένα - γλυκοσιδικός δεσμός με τις αντίστοιχες νουκλεϊκές βάσεις. Παρακαλώ σημειώστε: η ραχοκοκαλιά του φωσφοδιεστέρα ενός μόνο κλώνου DNA έχει "πολικότητα" (δηλαδή, μια συγκεκριμένη κατεύθυνση μπορεί να διακριθεί σε αυτήν, για παράδειγμα).

αντιπαράλληλη, δηλαδή η κατεύθυνση του ενός κυκλώματος και του άλλου. Μια τέτοια εικόνα μοιάζει με δύο παράλληλους δρόμους με μονόδρομη κυκλοφορία κατευθυνόμενη σε αντίθετες κατευθύνσεις. Ένας από τους δύο συμπληρωματικούς κλώνους DNA, που περιέχει πληροφορίες σχετικά με τη δομή ενός συγκεκριμένου γονιδίου με τη μορφή μιας συγκεκριμένης νουκλεοτιδικής αλληλουχίας, συνήθως ονομάζεται κωδικοποίηση (ή πρότυπο). η άλλη αλυσίδα που είναι συμπληρωματική σε αυτήν ονομάζεται μη κωδικοποίηση.

Όπως φαίνεται στο σχ. 37.3, σχηματίζονται τρεις δεσμοί υδρογόνου μεταξύ των υπολειμμάτων δεοξυγουανοσίνης και δεοξυκυτιδίνης και μόνο δύο μεταξύ θυμιδίνης και δεοξυαδενοσίνης. Επομένως, ο δεσμός G-C είναι ισχυρότερος κατά περίπου 50%. Αυτή η περίσταση, καθώς και οι αλληλεπιδράσεις στοίβαξης, μπορούν να εξηγήσουν την υψηλότερη θερμοκρασία μετουσίωσης (τήξης) των πλούσιων σε GC περιοχών DNA.

Δομή του DNA

Το DNA μπορεί να σχηματίσει διάφορους τύπους διπλών ελίκων. Επί του παρόντος, έξι μορφές είναι ήδη γνωστές (από Α έως Ε και Ζ-μορφή). Οι περισσότερες από τις δομικές παραλλαγές του DNA μπορούν να υπάρχουν μόνο κάτω από αυστηρά ελεγχόμενες πειραματικές συνθήκες. Αυτές οι επιλογές διαφέρουν 1) ως προς τον αριθμό των ζευγών βάσεων ανά μία στροφή της διπλής έλικας. 2) η απόσταση μεταξύ των επιπέδων των ζευγών βάσεων και η γωνία που σχηματίζουν με τον άξονα της έλικας. 3) η διάμετρος της σπείρας. 4) προσανατολισμός (δεξιά, αριστερά) της διπλής έλικας (Πίνακας 37. 1).

Μερικές από αυτές τις μορφές αλλάζουν η μία στην άλλη με αλλαγές στη συγκέντρωση αλατιού και στον βαθμό ενυδάτωσης. Είναι πιθανό ότι οι μεταβάσεις μεταξύ διαφορετικών δομικών μορφών DNA συμβαίνουν επίσης in vivo.

Ρύζι. 37.2. Το μοντέλο των Watson και Crick για τη δομή της διπλής έλικας σχήματος Β. Αριστερά: Σχηματική αναπαράσταση μορίου (Α - αδενίνη, C - κυτοσίνη, G - γουανίνη, Τ - θυμίνη, P - φωσφορικό, S-σάκχαρο [δεοξυριβόζη]). Δεξιά: Μοντέλο δομής DNA. (Φωτογραφία από J.D. Watson, Molecular biology of the Gene 3rd ed. Copyrght 1976, 1970, 1965 by W. A. ​​Benjamin, Inc., Menlo Park, Καλιφόρνια)

Υπό φυσιολογικές συνθήκες (χαμηλή συγκέντρωση άλατος, υψηλός βαθμός ενυδάτωσης), ο κυρίαρχος δομικός τύπος του DNA είναι η Β-μορφή. Το βήμα της έλικας ενός τέτοιου μορίου είναι 3,4 nm. Ένα πηνίο DNA μπορεί να αναπαρασταθεί ως δύο στριμμένες στοίβες "νομισμάτων", 10 σε κάθε μία. Οι στοίβες συγκρατούνται μεταξύ τους με δεσμούς υδρογόνου μεταξύ δύο αντίθετων «νομισμάτων» των στοίβων και είναι «τυλιγμένες» με δύο κορδέλες φωσφοδιεστερικής ραχοκοκαλιάς στριμμένες σε δεξιόστροφη έλικα. Σε συνθήκες λιγότερο υψηλής ενυδάτωσης και με υψηλότερη περιεκτικότητα σε ιόντα Na + ή K +, προκύπτει μια ελαφρώς διαφορετική δομή - η λεγόμενη μορφή Α. Αυτή η δεξιόστροφη διαμόρφωση έχει μεγαλύτερη διάμετρο έλικας από τη μορφή Β και μεγαλύτερο αριθμό ζευγών βάσεων ανά στροφή. Είναι παρόμοιο με τη χαρακτηριστική δομή των δίκλωνων διπλών RNA ή RNA-DNA. Οι μορφές C-E είναι επίσης δεξιόχειρες, ο σχηματισμός τους μπορεί να παρατηρηθεί μόνο σε ειδικά πειράματα και, προφανώς, δεν υπάρχουν in vivo.

σχήμα Ζ. Το DNA είναι μια αριστερόστροφη διπλή έλικα, στην οποία η ραχοκοκαλιά του φωσφοδιεστέρα είναι ζιγκ-ζαγκ κατά μήκος του άξονα του μορίου. Εξ ου και το όνομα του μορίου (ζιγκ-ζαγκ)-DNA. Το Z-DNA είναι το λιγότερο στριμμένο (12 ζεύγη βάσεων ανά στροφή) και το λεπτότερο γνωστό στη φύση, έχει μόνο ένα αυλάκι (βλ. παρακάτω). Το Z-DNA ανιχνεύεται σε επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες εναλλασσόμενων δεοξυνουκλεοτιδίων πουρίνης και πυριμιδίνης (GC ή AC) παρουσία ενός αριθμού άλλων σταθεροποιητικών παραγόντων. Αυτά περιλαμβάνουν: 1) υψηλή συγκέντρωση άλατος ή παρουσία ειδικών κατιόντων όπως η σπερμίνη και η σπερμιδίνη. 2) υψηλή περιεκτικότητα αρνητικών υπερπηνίων στο μόριο DNA (βλ. Κεφ. 38). 3) δέσμευση ειδικών πρωτεϊνών Z-DNA. 4) μεθυλίωση του ατόμου άνθρακα-5 ορισμένων υπολειμμάτων δεοξυκυτιδίνης.

Το DNA στη μορφή Ζ μπορεί να εμπλέκεται στη ρύθμιση της έκφρασης γονιδίων τόσο κοντά όσο και σημαντικά απομακρυσμένα από τη θέση Ζ. Ορισμένες πρωτεΐνες που συνδέονται στις κύριες ή δευτερεύουσες αύλακες του Β-μορφής DNA είναι πιθανό να μην μπορούν να συνδεθούν με τη μορφή Ζ του DNA. Επιπλέον, η αναστροφή ενός τμήματος DNA από τη μορφή Ζ στη μορφή Β του DNA, η οποία συμβαίνει, για παράδειγμα, ως αποτέλεσμα της απώλειας μεθυλομάδων από τη β-μεθυλδεοξυκυτιδίνη. μπορεί να επηρεάσει την κατάσταση στρέψης των τμημάτων DNA που βρίσκονται σε σημαντική απόσταση από την περιοχή της αναστροφής.

Ρύζι. 37.3. Σχηματισμός δύο δεσμών υδρογόνου (διακεκομμένη γραμμή) μεταξύ βάσεων δεοξυαδενοσίνης και θυμιδίνης (πάνω) και τριών δεσμών υδρογόνου μεταξύ βάσεων δεοξυγουανοσίνης και δεοξυκυτιδίνης (κάτω). Στο DNA, το υπόλειμμα υδατανθράκων είναι 2-δεοξυριβόζη, στο RNA, D-ριβόζη

Το DNA συστροφής-ξετύλιξης στρέψης, καθώς και η μεθυλίωση με δεοξυκυτιδίνη, πιθανώς επηρεάζουν τη γονιδιακή δραστηριότητα (βλ. παρακάτω).

Η παρουσία του Z-DNA στα χρωμοσώματα της Drosophila (μύγας φρούτων) έχει αποδειχθεί χρησιμοποιώντας αντισώματα ειδικά για τη μορφή Ζ του DNA. Υπάρχουν περιοχές στο ανθρώπινο DNA που είναι δυνητικά ικανές να μετασχηματιστούν στη μορφή Ζ. διασπείρονται στο γονιδίωμα.

Πίνακας 37.1. Χαρακτηρισμός ορισμένων τύπων δομών DNA

Υπάρχει λόγος να πιστεύουμε ότι οι συνθήκες που είναι απαραίτητες για τη σταθεροποίηση της Ζ-μορφής μπορούν επίσης να πραγματοποιηθούν σε ανθρώπινα κύτταρα.

Μετουσίωσης (τήξη) του DNA

Η δίκλωνη δομή του DNA μπορεί να «λειώσει» σε διάλυμα αυξάνοντας τη θερμοκρασία ή μειώνοντας τη συγκέντρωση του άλατος. Κατά τη διάρκεια της τήξης, όχι μόνο η αλυσίδα του DNA αποκλίνει, αλλά διαταράσσεται επίσης το σύστημα αλληλεπιδράσεων στοίβαξης των νουκλεϊκών βάσεων εντός αυτής της αλυσίδας. Οι φωσφοδιεστερικοί δεσμοί δεν σπάνε σε αυτή την περίπτωση. Η μετουσίωση του DNA συνοδεύεται από αύξηση της οπτικής απορρόφησης βάσεων πουρίνης και πυριμιδίνης. Αυτό το φαινόμενο ονομάζεται υπερχρωμική επίδραση της μετουσίωσης του DNA. Η μετουσίωση εξαλείφει επίσης το υψηλό ιξώδες που είναι εγγενές σε διαλύματα φυσικού DNA, η δομή του οποίου μοιάζει με ίνα οφείλεται τόσο στις αλληλεπιδράσεις στοίβαξης των νουκλεϊκών βάσεων σε κάθε κλώνο όσο και στις συμπληρωματικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ δύο κλώνων.

Ο διαχωρισμός των αλυσίδων ενός δεδομένου μορίου DNA συμβαίνει μέσα σε ένα συγκεκριμένο εύρος θερμοκρασίας. Το μέσο αυτού του διαστήματος ονομάζεται σημείο τήξης του DNA ή . Η τιμή εξαρτάται από τη νουκλεοτιδική σύνθεση του DNA και τη συγκέντρωση άλατος στο διάλυμα. Μόρια DNA εμπλουτισμένα σε ζεύγη G-C (συνδέονται με τρεις γέφυρες υδρογόνου) «λιώνουν» σε υψηλότερη θερμοκρασία από τα πλούσια σε Α-Τ μόρια (τα ζεύγη Α-Τ ​​συνδέονται με δύο γέφυρες υδρογόνου). Μια δεκαπλάσια αύξηση στη συγκέντρωση των μονοσθενών κατιόντων αυξάνεται κατά 16,6 ° C. Η φορμαμίδη, που χρησιμοποιείται συνήθως σε πειράματα με ανασυνδυασμένο DNA, αποσταθεροποιεί τους δεσμούς υδρογόνου μεταξύ των βάσεων, μειώνοντας έτσι το . Αυτό επιτρέπει στους κλώνους του υβριδίου DNA ή DNA-RNA να αποκλίνουν σε χαμηλότερη τιμή, γεγονός που μειώνει την πιθανότητα να συμβούν μεμονωμένα σπασίματα σε υψηλή θερμοκρασία.

αυλακώσεις στη δομή του DNA

Κατά τη μελέτη του μοντέλου που φαίνεται στο Σχ. 37.2, μπορεί κανείς να δώσει προσοχή στην παρουσία στη δομή του DNA μεγάλων και δευτερευόντων αυλακώσεων, στριμμένων γύρω από τον άξονα του μορίου παράλληλο με τη ραχοκοκαλιά του φωσφοδιεστέρα. Σε αυτές τις αυλακώσεις, οι πρωτεΐνες μπορούν να αλληλεπιδράσουν ειδικά με ορισμένα άτομα νουκλεϊνικών βάσεων και, ως εκ τούτου, να «αναγνωρίσουν» συγκεκριμένες αλληλουχίες νουκλεοτιδίων χωρίς να διαταράξουν τις συμπληρωματικές αλληλεπιδράσεις στη δομή της διπλής έλικας. Όπως θα φανεί στο Κεφ. 39 και 41, μέσω τέτοιων αλληλεπιδράσεων οι ρυθμιστικές πρωτεΐνες μπορούν να ελέγχουν την έκφραση γονιδίων.

Χαλαρό και υπερτυλιγμένο DNA

Το DNA ορισμένων οργανισμών, όπως τα βακτήρια, οι βακτηριοφάγοι και πολλοί ιοί του DNA των ζώων, είναι μια κλειστή κυκλική δομή. Φυσικά, μια τέτοια δομή δεν παραβιάζει την πολικότητα των μορίων, αλλά οι ελεύθερες και οι ομάδες υδροξυλίου και φωσφορυλίου εξαφανίζονται σε αυτήν. Οι κλειστοί δακτύλιοι μπορούν να υπάρχουν σε χαλαρές ή υπερτυλιγμένες μορφές. Η υπερέλιξη εκδηλώνεται όταν ένας κλειστός δακτύλιος περιστρέφεται γύρω από τον άξονά του ή όταν ένα τμήμα γραμμικού DNA συστρέφεται, τα άκρα του οποίου είναι σταθερά. Αυτή η διαδικασία που απαιτεί ενέργεια οδηγεί στην εμφάνιση ενός ενδομοριακού στελέχους της δομής. Με την αύξηση του αριθμού των υπερπηνίων, η εσωτερική τάση (στρέψης) αυξάνεται (ελέγξτε αυτό σε ένα συνηθισμένο λάστιχο). Τα υπερπηνία στο DNA που σχηματίζονται με περιστροφή αριστερόστροφα (στην αντίθετη κατεύθυνση της συστροφής της δεξιάς διπλής έλικας της Β-μορφής του DNA) ονομάζονται αρνητικά. Κατά μία έννοια, μπορούμε να υποθέσουμε ότι η ενέργεια που απαιτείται για την επίτευξη μιας τέτοιας δομικής κατάστασης αποθηκεύεται σε συνηθισμένα (μη αρνητικά) υπερπηνία. Η ενέργεια της μετάβασης ενός μορίου DNA σε άλλο τύπο υπερμοριακής δομής μπορεί να μειωθεί λόγω του σχηματισμού περιοχών αρνητικής συστροφής. Μια τέτοια μετάβαση είναι ο διαχωρισμός κλώνων κατά την προετοιμασία για αντιγραφή και μεταγραφή. Αυτός είναι ο λόγος για τον οποίο η υπερέλιξη του DNA είναι εξαιρετικά ευεργετική στα βιολογικά συστήματα. Τα ένζυμα που καταλύουν τοπολογικές αλλαγές στο μόριο του DNA ονομάζονται τοποϊσομεράσες. Το πιο μελετημένο από αυτά είναι η βακτηριακή γυράση, η οποία προκαλεί το σχηματισμό αρνητικών υπερπηνίων.

Λειτουργία του DNA

Η γενετική πληροφορία που κωδικοποιείται σε μια νουκλεοτιδική αλληλουχία εξυπηρετεί δύο σκοπούς. Πρώτον, είναι απαραίτητο για τη σύνθεση πρωτεϊνικών μορίων και δεύτερον, εξασφαλίζει τη μεταφορά του σε μια σειρά κυτταρικών γενεών και γενεών οργανισμών. Και οι δύο λειτουργίες βασίζονται στο γεγονός ότι το μόριο DNA χρησιμεύει ως πρότυπο. στην πρώτη περίπτωση για μεταγραφή - επανακωδικοποίηση πληροφοριών στη δομή των μορίων RNA και στη δεύτερη για αντιγραφή - αντιγραφή πληροφοριών σε θυγατρικά μόρια DNA.

Η συμπληρωματικότητα των κλώνων διπλής έλικας Watson και Crick υποδηλώνει έναν ημι-συντηρητικό τρόπο αντιγραφής του DNA. Αυτό σημαίνει ότι οι αλυσίδες αποκλίνουν και η καθεμία χρησιμεύει ως πρότυπο για τη σύνθεση μιας νέας συμπληρωματικής ακολουθίας (Εικ. 37.4). Τα δύο προκύπτοντα δίκλωνα μόρια DNA, καθένα από τα οποία αποτελείται από έναν γονέα και έναν συμπληρωματικό κλώνο που πρόσφατα συντέθηκε, κατανέμονται μεταξύ δύο θυγατρικών κυττάρων (Εικ. 37.5). Έτσι, καθένα από τα θυγατρικά κύτταρα λαμβάνει πληροφορίες πανομοιότυπες με αυτές που κατέχει το γονικό κύτταρο. Κάθε ένα από τα δύο θυγατρικά κύτταρα διατηρεί έναν κλώνο του αρχικού γονικού DNA.

Ο ημι-συντηρητικός μηχανισμός αντιγραφής στο βακτήριο Escherichia coli αποδείχθηκε ξεκάθαρα στο κλασικό πείραμα από τους Meselson και Stahl χρησιμοποιώντας ένα βαρύ ισότοπο αζώτου σε συνδυασμό με φυγοκέντρηση ισορροπίας.

Ρύζι. 37.4. Δίκλωνη δομή του DNA. Καθένας από τους δύο κλώνους του μητρικού μορίου DNA χρησιμοποιείται ως πρότυπο για τη σύνθεση νέων συμπληρωματικών κλώνων. (Από J. D. Watson. Molecular biology of the Gene 3rd ed. Copyright 1976, 1970, 1965 by W. A. ​​Benjamin, Inc., Menlo Park,

Ρύζι. 37,5. Αναμενόμενη κατανομή κλώνων DNA σε ημι-συντηρητική και συντηρητική αντιγραφή. Στο σχήμα, οι μητρικές αλυσίδες είναι μαύρες και οι νέες αλυσίδες είναι ανοιχτόχρωμες. (Επανασχεδιάστηκε και αναπαρήχθη, με άδεια από τον Lehninger A. L. Biochemistry 2nd. ed., Worth, 1975.)

Το DNA του E. coli και το ανθρώπινο DNA είναι χημικά πανομοιότυπα, αν και, φυσικά, οι αλληλουχίες νουκλεοτιδίων τους είναι διαφορετικές, και επιπλέον, ένα ανθρώπινο κύτταρο περιέχει περίπου 1000 φορές περισσότερο DNA από ένα βακτηριακό. Αποδείχθηκε ότι ο χημικός μηχανισμός αντιγραφής του DNA είναι ο ίδιος στα προκαρυωτικά, όπως το E. coli, και στους ευκαρυώτες, συμπεριλαμβανομένων των ανθρώπων, παρά το γεγονός ότι τα ένζυμα που εμπλέκονται σε αυτές τις διαδικασίες διαφέρουν στα προκαρυωτικά και ευκαρυωτικά κύτταρα. Υπάρχει κάθε λόγος να πιστεύουμε ότι τα δεδομένα που λαμβάνονται στη μελέτη της χημείας των νουκλεϊκών οξέων των προκαρυωτικών οργανισμών ισχύουν και για ευκαρυωτικά συστήματα. Πράγματι, τα αποτελέσματα πειραμάτων με κύτταρα θηλαστικών παρόμοια με αυτά των Meselson και Stahl αποδείχθηκαν συγκρίσιμα με τα δεδομένα που ελήφθησαν νωρίτερα για το E. coli.

Εάν τα διαλύματα ιικού ή βακτηριακού DNA θερμαίνονται αργά, τότε τα μόριά τους μετουσιώνονται σε αρκετά συγκεκριμένες θερμοκρασίες (Εικ. 27-16). Η μετάβαση από το φυσικό διπλό DNA στη μη στριμμένη, τυχαία στριμμένη, μετουσιωμένη μορφή μπορεί να ανιχνευθεί με αύξηση της απορρόφησης υπεριώδους φωτός ή με μείωση του ιξώδους του διαλύματος DNA. Κάθε τύπος DNA έχει τη δική του θερμοκρασία μετουσίωσης, που ονομάζεται «σημείο τήξης». Όσο υψηλότερη είναι η περιεκτικότητα σε ζεύγη G=C στο DNA, τόσο υψηλότερο είναι το σημείο τήξης αυτού του DNA. Αυτό εξηγείται από το γεγονός ότι τα ζεύγη GC είναι πιο σταθερά και απαιτείται περισσότερη ενέργεια για τη διάστασή τους παρά για την καταστροφή των ζευγών A=T. Αυτό οφείλεται εν μέρει στο γεγονός ότι τα ζεύγη G=C συνδέονται με τρεις δεσμούς υδρογόνου και τα ζεύγη A=T μόνο με δύο.

Ο προσεκτικός προσδιορισμός του σημείου τήξης ενός παρασκευάσματος DNA υπό σταθερές συνθήκες pH και ιοντικής ισχύος μπορεί επομένως να παρέχει πληροφορίες για την αναλογία των ζευγών A=T και G=C στο DNA.

Η δεύτερη φυσική ιδιότητα του DNA, που προσδιορίζεται από την αναλογία των ζευγών G=C και A=T, είναι η πυκνότητα άνωσης. Το παρασκεύασμα DNA με υψηλότερη περιεκτικότητα σε G=C-nap έχει ελαφρώς μεγαλύτερη πυκνότητα από το DNA με υψηλότερη περιεκτικότητα σε ζεύγη Α=Τ. Τα παρασκευάσματα DNA φυγοκεντρούνται σε υψηλές ταχύτητες σε ένα συμπυκνωμένο διάλυμα χλωριούχου καισίου (), του οποίου η πυκνότητα βρίσκεται στο ίδιο εύρος με την πυκνότητα του DNA.

Ρύζι. 27-15. Η αρχή της δοκιμής υβριδισμού. Δύο παρασκευάσματα DNA που απομονώνονται από οργανισμούς διαφορετικών ειδών θερμαίνονται έτσι ώστε να μετουσιωθούν πλήρως και οι αλυσίδες τους να αποκλίνουν. Όταν αυτά τα παρασκευάσματα αναμειγνύονται και ψύχονται αργά, οι συμπληρωματικοί κλώνοι DNA κάθε είδους θα βρεθούν μεταξύ τους και θα ανόπτονται για να σχηματίσουν κανονικά διπλά. Εάν υπάρχει σημαντική ομολογία στην αλληλουχία μεταξύ δύο DNA, τότε είναι δυνατός ο σχηματισμός υβριδικών μορίων, τα οποία είναι μερικώς διπλά. Όσο υψηλότερος είναι ο βαθμός ομολογίας, τόσο πιο πιθανός είναι ο σχηματισμός υβριδίων. Η περιεκτικότητα σε υβρίδια σε ένα μείγμα μπορεί να μετρηθεί με διάφορους τρόπους, ιδιαίτερα με χρωματογραφία ή φυγοκέντρηση βαθμίδωσης πυκνότητας. Συνήθως, για να απλοποιηθεί η διαδικασία μέτρησης, ένα από τα DNA επισημαίνεται με ένα ραδιενεργό ισότοπο.

Ρύζι. 27-16. Καμπύλη μετουσίωσης (τήξης) δύο παρασκευασμάτων DNA. Η θερμοκρασία που αντιστοιχεί στο μεσαίο σημείο μετάπτωσης ονομάζεται σημείο τήξης. Δεδομένου ότι η τιμή εξαρτάται από το pH και τη συγκέντρωση άλατος, είναι πάντα απαραίτητο να προσδιορίζονται οι συνθήκες για τη μέτρησή του.

Κατά τη διάρκεια της φυγοκέντρησης σε ένα σωλήνα φυγοκέντρησης, σχηματίζεται μια κλίση πυκνότητας με την υψηλότερη πυκνότητα στο κάτω μέρος του σωλήνα. Εάν τοποθετηθεί DNA σε αυτό, τότε πρώτα θα κινηθεί προς το κάτω μέρος του δοκιμαστικού σωλήνα, αλλά στη συνέχεια θα σταματήσει σε μια συγκεκριμένη θέση και θα παραμείνει στην επιφάνεια. Σε αυτή τη θέση, δεν μπορεί ούτε να ανέβει ούτε να καθιζάνει, αφού η πυκνότητα του διαλύματος εδώ είναι ίση με την πυκνότητά του. Με αυτή τη μέθοδο, η οποία περιγράφεται λεπτομερέστερα στο Κεφ. 28, είναι δυνατόν να διαχωριστούν μόρια DNA που διαφέρουν ως προς την περιεκτικότητα σε ζεύγη G=C μεταξύ τους, καθώς έχουν διαφορετικές πυκνότητες άνωσης. Με βάση την πυκνότητα άνωσης αυτού του DNA, μπορούμε να υπολογίσουμε την αναλογία των ζευγών G=C και A=T σε αυτό.

Υβριδισμός DNA

Υβριδισμός DNA, υβριδισμός νουκλεϊκού οξέος- σύνδεση in vitroσυμπληρωματικά μονόκλωνα νουκλεϊκά οξέα σε ένα μόριο. Με την πλήρη συμπληρωματικότητα, ο συνδυασμός είναι εύκολος και γρήγορος, και στην περίπτωση μερικής μη συμπληρωματικότητας, η συγχώνευση των αλυσίδων επιβραδύνεται, γεγονός που καθιστά δυνατή την αξιολόγηση του βαθμού συμπληρωματικότητας. Ο υβριδισμός DNA-DNA και DNA-RNA είναι δυνατός.

Πρωτόκολλο πειράματος

1. Το δίκλωνο DNA θερμαίνεται σε κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα. Λόγω αλλαγών στις εξωτερικές συνθήκες, οι δεσμοί υδρογόνου μεταξύ συμπληρωματικών αζωτούχων βάσεων γίνονται θερμοδυναμικά δυσμενείς και οι αλυσίδες αποκλίνουν.
2. Το παρασκεύασμα μετουσιωμένου DNA αναμιγνύεται με άλλο μετουσιωμένο DNA.
3. Τα παρασκευάσματα ψύχονται αργά, ενώ τα μονόκλωνα DNA συγκολλούνται μεταξύ τους (σχηματίζονται δεσμοί υδρογόνου μεταξύ συμπληρωματικών βάσεων) και σχηματίζεται ένα «υβριδικό» μόριο DNA.

Μια ανάλυση του ρυθμού ανόπτησης του μονόκλωνου DNA καθιστά δυνατή την αξιολόγηση των ομοιοτήτων και διαφορών στις αλληλουχίες DNA μεταξύ ειδών ή ατόμων του ίδιου είδους.

Υπολογισμός Σημείου Τήξης DNA

Η δευτερογενής δομή του DNA παίζει σημαντικό ρόλο στη βιολογία, τη γενετική διάγνωση και άλλες μεθόδους μοριακής βιολογίας και νανοτεχνολογίας. Επομένως, ο ακριβής προσδιορισμός του σημείου τήξης των μορίων DNA ή RNA παίζει τον πιο σημαντικό ρόλο σε όλες τις μοριακές βιολογικές μεθόδους, όπως η επιλογή δειγμάτων ή ολιγονουκλεοτιδίων για μικροσυστοιχίες ή η επιλογή εκκινητών PCR. Υπάρχουν αρκετοί απλοί τύποι για τον υπολογισμό του σημείου τήξης για μικρά ολιγονουκλεοτίδια. Πρόχειρος υπολογισμός του σημείου τήξης (Tm) ενός μικρού ολιγονουκλεοτιδίου (<20 нуклеотидов) проводят по прямому подсчету количества нуклеотидов (G+C - сумма всех гуанинов и цитозинов , L - длина олигонуклеотида):

Ο μέσος τύπος για τον υπολογισμό του T m για ένα βραχύ ολιγονουκλεοτίδιο (και για μακρά θραύσματα DNA), λαμβάνοντας υπόψη τη συγκέντρωση ιόντων K + και DMSO:

Ωστόσο, αυτές οι εξισώσεις δεν λαμβάνουν υπόψη την έναρξη δέσμευσης κατά τον υβριδισμό ολιγονουκλεοτιδίων, δεν λαμβάνουν υπόψη τα χαρακτηριστικά της ίδιας της αλληλουχίας και το τελικό αποτέλεσμα που είναι χαρακτηριστικό των διπλών ολιγονουκλεοτιδίων. Επομένως, αυτός ο τύπος είναι καταλληλότερος όταν η αλληλουχία DNA είναι μέση και το μήκος των διπλών είναι πάνω από 40 νουκλεοτίδια.

Θερμοδυναμική DNA

Η πιο κοινή μέθοδος που χρησιμοποιείται σήμερα για τον υπολογισμό της θερμοκρασίας τήξης του δίκλωνου ή μονόκλωνου DNA βασίζεται σε ένα θερμοδυναμικό μοντέλο δύο σταδίων. Δύο συμπληρωματικά μόρια DNA Α και Β είναι είτε συνδεδεμένα μεταξύ τους είτε ελεύθερα σε διάλυμα («τυχαία κατάσταση πηνίου»). Συνήθως θεωρείται ότι και τα δύο μόρια Α και Β είναι εντελώς συμπληρωματικά, επομένως ο υβριδισμός τους είναι προφανής και επιτρέπονται ένα ή περισσότερα σφάλματα συμπληρωματικότητας στο διπλό, συμπεριλαμβανομένων των μη συμπληρωματικών ζευγών G-G, G-T και G-A (ζεύγη ταλάντωσης). Στην περίπτωση ενός μόνο μορίου, υποτίθεται ότι το συσκευάζει σε μια δομή βρόχου. Η διαδικασία υβριδισμού σε διπλή όψη περιγράφεται από τον τύπο:

όπου το Α και το Β είναι διαφορετικές αλυσίδες σε διάλυμα ("τυχαία κατάσταση πηνίου"), και το ΑΒ είναι το σχηματιζόμενο διπλό. Αυτή η αντίδραση είναι αναστρέψιμη. Η σταθερά ισορροπίας k, για αυτή την αντίδραση ορίζεται ως: .

Η σταθερά ισορροπίας εξαρτάται από τη συγκέντρωση της αλυσίδας, τη θερμοκρασία, τη συγκέντρωση άλατος, το pH και άλλα συστατικά της αντίδρασης (π.χ. γλυκερίνη ή DMSO). Η σταθερά K αλλάζει ως απόκριση σε μια αλλαγή στη συγκέντρωση μιας ή και των δύο αλυσίδων ( και / ή ), τότε ολόκληρο το σύστημα ανταποκρίνεται στις αλλαγές και στη συνέχεια οι επιμέρους συγκεντρώσεις των [A], [B] και επίσης αλλάζουν. Για παράδειγμα, εάν υπάρχει περισσότερη αλυσίδα Α στο σύστημα, τότε η συγκέντρωση θα αυξηθεί. Ας υποθέσουμε ότι η σταθερά ισορροπίας είναι 1,81x10 6 και η συγκέντρωση των αλυσίδων = = 10 -5 M:

Αντικαθιστούμε τα συστατικά στους τύπους για τον υπολογισμό του k:

Μετά την αναδιάταξη, παίρνουμε:

Για παράδειγμα, αντικαθιστώντας σε αυτόν τον τύπο = 7,91x10 -6 M τότε η συγκέντρωση των αλυσίδων θα είναι [A] = [B] = 2,09x10 -6 M. Δηλαδή, μόνο το 79% των αλυσίδων θα συνδεθεί σε διπλή όψη.

Είναι δυνατός ο προσδιορισμός των σταθερών ισορροπίας με μεταβολή της θερμοκρασίας; Αυτό μας φέρνει στην κατανόηση σημαντικών θερμοδυναμικών παραμέτρων όπως η ελεύθερη ενέργεια (dG), η ενθαλπία (dH) και η εντροπία (dS). Αλλαγές στην ελεύθερη ενέργεια, την ενθαλπία και την εντροπία συμβαίνουν κατά τη μετάβαση από τη «θερμοκρασία υβριδισμού Τ» σε μια διαταραγμένη, τυχαία κατάσταση. Αυτοί οι λόγοι ορίζονται από τον τύπο dG = dH – TdS , (για τη συγκέντρωση των αλυσίδων [A] = [B] = = 1M), τότε ο ιδανικός τύπος για τον υπολογισμό της ελεύθερης ενέργειας Gibbs είναι:

όπου T είναι η θερμοκρασία σε kelvins, dH° (cal/mol) και dS° (cal/mol K).

Υπάρχει μια χρήσιμη σχέση που σχετίζεται με τη μεταβολή της ελεύθερης ενέργειας Gibbs κατά τη διάρκεια μιας χημικής αντίδρασης με τη σταθερά ισορροπίας της:

όπου R είναι η καθολική σταθερά αερίου (1,987cal/mol K).

Συνδυάζοντας και τους δύο τύπους παίρνουμε:

Η θερμοκρασία τήξης (T m) προσδιορίζεται σε κατάσταση ισορροπίας, όταν οι μισές αλυσίδες συνδέονται μεταξύ τους και οι άλλες μισές είναι σε ελεύθερη κατάσταση, δηλαδή k=1:

Το σημείο τήξης για έναν απλό βρόχο υπολογίζεται ως . Για το διπλό DNA, είναι απαραίτητο να ληφθεί υπόψη η συγκέντρωση κάθε κλώνου (σε moles, M). Έτσι, αν [A] και [B] είναι οι συγκεντρώσεις των μορίων Α και Β, τότε η συνολική συγκέντρωση των αλυσίδων, C, είναι ίση με το άθροισμά τους, [A] + [B].

Υποτίθεται ότι η συγκέντρωση και των δύο αλυσίδων είναι η ίδια [A] = [B] = C/2. Σε αυτήν την περίπτωση,

όπου f = 4. Για αυτοσυμπληρωματικό ολιγονουκλεοτίδιο = C και μετά f = 1. Αυτή η θερμοκρασία τήξης προσδιορίζεται μόνο όταν τα μισά μόρια είναι συνδεδεμένα μεταξύ τους.

Για ένα αυτοσυμπληρωματικό ολιγονουκλεοτίδιο, k = 1/ επομένως:

Για μια μη συμπληρωματική διπλή όψη, όταν ≥ , k =1/( – /2), το Tm υπολογίζεται ως εξής:

όπου είναι η μοριακή συγκέντρωση του κυρίαρχου κλώνου (συνήθως εκκινητής PCR) και [Bt] είναι η μοριακή συγκέντρωση του κλώνου χαμηλής συγκέντρωσης (γονιδιωματικό DNA).

Υπολογισμός σημείου τήξης

Οι θερμοδυναμικές παράμετροι dG, dH και dS υπολογίζονται με βάση το μοντέλο του πλησιέστερου γείτονα. Η ακριβής πρόβλεψη της δευτερογενούς δομής του DNA κατά τη διάρκεια του υβριδισμού χρησιμοποιώντας αλγόριθμους δυναμικού προγραμματισμού απαιτεί μια βάση δεδομένων με όλες τις πιθανές θερμοδυναμικές παραμέτρους για κάθε συμπληρωματικό ζεύγος βάσεων, καθώς και για όλες τις αναντιστοιχίες, ελεύθερα άκρα, φουρκέτες και βρόχους. Ο θερμοδυναμικός τύπος για τον υπολογισμό ενός μικρού ολιγονουκλεοτιδίου βασίζεται στις θερμοδυναμικές παραμέτρους - εντροπία dS και ενθαλπία dH, για καθέναν από τους 10 συνδυασμούς τεσσάρων νουκλεοτιδίων (Πίνακας 1). Ο Πίνακας 1 δείχνει τις θερμοδυναμικές παραμέτρους για τους πλησιέστερους γείτονες (NN) για ζεύγη νουκλεοτιδίων σε συγκέντρωση 1M NaCl.

Για τον υπολογισμό του Tm (°С), όλες οι τιμές ελεύθερης ενέργειας Gibbs για κάθε ζεύγος αθροίζονται σε προσαυξήσεις ενός νουκλεοτιδίου:

dG γενική = dG αρχική + dG συμμετρία +∑dG + dG AT τέλος

dG θεωρητικό = 1,96 + 0 - 2,17 - 1,44 - 1,44 - 1,00 - 1,45 - 1,30 +0,05

dG θεωρητικό = -5,35 kcal/mol

Οι τιμές εντροπίας (dH = -43,5 kcal/mol) και ενθαλπίας (dS = -122,5) υπολογίζονται με παρόμοιο τρόπο:

Πολλά διπλά DNA έχουν ανταγωνιστικές μονόκλωνες δομές, και αυτό μεταβάλλει την ισορροπία του συστήματος και, ως αποτέλεσμα, μια μείωση στην τιμή Tm από την τιμή που προβλέπεται από τον τύπο.

Ο γενικός τύπος για τον υπολογισμό του Tm με διόρθωση για το αλάτι στο διάλυμα είναι:

όπου L είναι το μήκος του ολιγονουκλεοτιδίου, R είναι η σταθερά αερίου (1,987cal/K mol), c είναι η συγκέντρωση του ολιγονουκλεοτιδίου σε (συνήθως 2x10 −7 M), είναι η συγκέντρωση των ιόντων καλίου σε mol (συνήθως 5x10 − 2 Μ).

Πίνακας 1. Θερμοδυναμικές παράμετροι για τους πλησιέστερους γείτονες (NN) για ζεύγη νουκλεοτιδίων σε συγκέντρωση 1M NaCl,

Ακολουθία ζευγαριών (5"-3"/3"-5")	° kcal/mol	° cal/(mol K)	° 37 kcal/mol
AA/TT	-7.6	-21.3	-1.00
AT/TA	-7.2	-20.4	-0.88
ΤΑ/ΑΤ	-7.2	-20.3	-0.58
CA/GT	-8.5	-22.7	-1.45
GT/CA	-8.4	-22.4	-1.44
CT/GA	-7.8	-21.0	-1.28
GA/CT	-8.2	-22.2	-1.30
CG/GC	-10.6	-27.2	-2.17
GC/CG	-9.8	-24.4	-2.24
GG/CC	-8.0	-19.9	-1.84
την έναρξη	+0.2	-5.7	+1.96
ζεύγος ακροδεκτών Α-Τ	+2.2	+6.9	+0.05
διόρθωση συμμετρίας	0.0	-1.4	+0.43

Μονό σφάλμα εντός διπλής όψης

Το μοντέλο πλησιέστερου γείτονα για συμπληρωματικά ζεύγη νουκλεοτιδίων μπορεί να επεκταθεί σε ζεύγη που περιλαμβάνουν μη συμπληρωματικά νουκλεοτίδια. Έχει αποδειχθεί ότι υπάρχει μια πτωτική τάση στη σταθερότητα των μη συμπληρωματικών ζευγών βάσεων σε φθίνουσα σειρά:

G-C > ΣΤΟ> G G > G T ≥ G A > T T ≥ A A > T C ≥ A C ≥ C C

Η γουανιδίνη G είναι η πιο «ακατάστατη» βάση γιατί σχηματίζει ισχυρά ζεύγη βάσεων με μη συμπληρωματικές βάσεις (G·G, G·T και G·A). Από την άλλη πλευρά, η κυτοσίνη C είναι η πιο διακριτική βάση επειδή σχηματίζει τα πιο σταθερά συμπληρωματικά ζεύγη και ασταθή ζεύγη με μη συμπληρωματικές βάσεις (T·C ≥ A·C ≥ C·C), .

Συνδέσεις

δείτε επίσης

• PrimerDigital: διαδικτυακά εργαλεία για ανάλυση PCR και ολιγονουκλεοτιδίων