Химические свойства пигментов листа
Важнейшими компонентами фотосинтетического аппарата растений являются пигменты. Пигменты делятся на два класса: тетрапиррольные соединения (хлорофиллы и фикобилины ) и полиизопреноидные (каротиноиды ).
Фикобилины - это пигменты водорослей . У высших растений обнаружены хлорофилл «а», хлорофилл «b» и каротиноиды. Основным функциональным пигментом является хлорофилл «a», который обнаружен у всех фотосинтезирующих организмов (кроме бактерий). Он служит непосредственным донором энергии для фотосинтетических реакций. Остальные пигменты, лишь передают поглощенную энергию хлорофиллу «а».
DIV_ADBLOCK267">
Рис. 17 Структурные формулы каротиноидов и последовательность их превращений
При этом в циклических каротинах шестичленные кольца представлены двумя типами: β-иононовыми и α-иононовыми.
В фотосинтезирующих организмах эта группа желтых пигментов представлена ликопином, α-каротином, β-каротином и γ-каротином. У высших растений основным каротином является β-каротин.
Ксантофиллы - кислородсодержащие производные каротинов, включающие в себя лютеин (С40Н56О2), зеаксантин (С40Н56О4), виолаксантин (С40Н56О4), неоксантин (С40Н56О4) (рис. 17). Среди названных ксантофиллов преобладает лютеин, который по химической структype очень близок к α-каротину, но в отличие от него является двухатомным спиртом, т. е. в каждом ионовом кольце, один атом водорода замещен на гидроксильную группу.
Функции каротиноидов: 1) являются дополнительными пигментами; 2) защищают молекулы хлорофилла от фотоокисления; 3) играют роль в кислородном обмене при фотосинтезе.
Принцип метода: пигменты из растительной ткани извлекают полярными растворителями (этиловый спирт, ацетон), которые разрушают связь хлорофиллов и ксантофиллов с липопротеидами пластид и обеспечивают их полное экстрагирование. Неполярные растворители (петролейный эфир, гексан, бензин и др.) не нарушают связи этих пигментов с белками.
Цель работы: познакомиться с химическими свойствами пигментов листа.
Ход работы: 1. Получение спиртового раствора пигментов . Для получения вытяжки пигментов используют как сырой, так и сухой растительный материал. Высушенные листья предварительно обрабатывают горячей водой, чтобы облегчить последующее извлечение пигментов.
Свежие листья растений (1 г) мелко измельчить ножницами, поместить в ступку и растереть с небольшим количеством СаСО3. Постепенно в ступку приливать 2…3 мл этилового спирта и тщательно растереть навеску до получения однородной массы. Затем прилить еще 5…8 мл спирта, содержимое перемешать. Носик ступки снизу смазать вазелином и по стеклянной палочке содержимое ступки перенести на бумажный фильтр. Полученный фильтрат поместить в пробирку. Спиртовая вытяжка содержит сумму зеленых и желтых пигментов.
2.Разделение пигментов по Краусу основано на различной растворимости пигментов в спирте и бензине. Эти растворители при сливании не смешиваются, а образуют две фазы верхнюю бензиновую и нижнюю спиртовую, благодаря чему и разделяются компоненты смеси пигментов.
В пробирку налить 2…3 мл спиртового экстракта пигментов и добавить 3…4 мл бензина. Содержимое пробирки сильно встряхнуть, предварительно закрыв ее пробкой или большим пальцем, и оставить отстояться. Для лучшего разделения добавить 1…2 капли воды.
По мере расслоения эмульсии верхний бензиновый слой будет окрашиваться в зеленый цвет, из-за лучшей растворимости в нем хлорофиллов. Кроме того, в бензин переходит каротин, но его окраска маскируется хлорофиллом. Ксантофилл остается в нижнем спиртовом слое, придавая ему золотисто-желтую окраску.
Если пигменты разделятся недостаточно четко, добавить 1…2 капли воды и снова встряхнуть. При избытке воды возможно помутнение нижнего слоя, тогда следует прилить немного этилового спирта и взболтать содержимое пробирки.
Зарисовать распределение пигментов в спирте и бензине, сделать выводы о различной их растворимости.
3. Омыление хлорофилла щелочью. При обработке хлорофилла щелочью происходит омыление эфирных групп, т. е. отщепление остатков метилового спирта и фитола (рис. 18). Образуется натриевая соль хлорофиллиновой кислоты, сохраняющая зеленую окраску и оптические свойства хлорофилла, но отличающаяся большей гидрофильностью, по сравнению с нативным пигментом.
Рис. 18 Омыление хлорофилла щелочью
В пробирку с 2…З мл спиртового раствора пигментов прилить 1 мл 20% раствора NaOH и взболтать. После смешивания экстракта со щелочью пробирку поместить в кипящую водяную баню, довести до кипения и охладить.
К охлажденному раствору прилить равный объем бензина и несколько капель воды для лучшего разделения смеси. Затем содержимое пробирки резко встряхнуть и дать ему отстояться.
В бензиновый слой перейдут каротин и ксантофилл, а в спиртовый - натриевая соль хлорофиллиновой кислоты.
Зарисовать окраску слоев, указав распределение пигментов3. Получение феофитина и обратное замещение водорода атомом металла. Атом магния слабо удерживается в порфириновом ядре хлорофилла и при осторожном воздействии сильных кислот легко замещается двумя протонами, что приводит к образованию феофитина бурого цвета.
Если на феофитин подействовать солями меди, цинка или ртути, то вместо двух протонов в ядро входит соответствующий металл и вновь восстанавливается зеленая окраска. Однако она несколько отличается от окраски хлорофилла. Следовательно, цвет хлорофиллов зависит от металлоорганической связи в их молекуле.
В пробирку налить 2…3 мл спиртовой вытяжки пигментов и прибавить 1…2 капли 10% раствора соляной кислоты. В ходе реакции зеленый цвет меняется на бурый, при этом хлорофилл превращается в феофитин. Содержимое пробирки разлить в две пробирки.
Одну пробирку с феофитином оставить для контроля, а во вторую поместить несколько кристаллов уксуснокислой меди и нагреть раствор на водяной бане до кипения. После нагревания бурый цвет раствора меняется на зеленый в результате образования хлорофиллоподобного производного меди.
Зарисовать окраску феофитина и медьпроизводного хлорофилла.
https://pandia.ru/text/80/159/images/image005_49.gif" width="541" height="135 id=">
хлорофиллоподобное производное меди
Оборудование и материалы: 1) свежие листья растений; 2) этиловый спирт; 3) бензин; 4) 20% раствор NaOH; 5) 10% соляная кислота в капельнице; 6) 10% соляная кислота; 7) водяная баня; 8) штатив с пробирками; 9) пипетки на 1 мл или мерные пробирки; 10) воронки; 11) фильтровальная бумага; 12) ступка с пестиком; 13) стеклянные палочки; 14) ножницы.
Почему растения зеленые?
Сложность:
Опасность:
Сделайте этот эксперимент дома
Реагенты
Безопасность
- Перед началом опыта наденьте защитные перчатки и очки.
- Проводите эксперимент на подносе.
- Проводите опыт в хорошо проветриваемом помещении, вдали от источников возгорания.
Общие правила безопасности
- Не допускайте попадания химических реагентов в глаза или рот.
- Не допускайте к месту проведения экспериментов людей без защитных очков, а также маленьких детей и животных.
- Храните экспериментальный набор в месте, недоступном для детей младше 12 лет.
- Помойте или очистите всё оборудование и оснастку после использования.
- Убедитесь, что все контейнеры с реагентами плотно закрыты и хранятся по правилам после использования.
- Убедитесь, что все одноразовые контейнеры правильно утилизированы.
- Используйте только оборудование и реактивы, поставляемые в наборе или рекомендуемые текущими инструкциями.
- Если вы использовали контейнер для еды или посуду для проведения экспериментов, немедленно выбросьте их. Они больше не пригодны для хранения пищи.
Информация о первой помощи
- В случае попадания реагентов в глаза тщательно промойте глаза водой, при необходимости держа глаз открытым. Немедленно обратитесь к врачу.
- В случае проглатывания промойте рот водой, выпейте немного чистой воды. Не вызывайте рвоту. Немедленно обратитесь к врачу.
- В случае вдыхания реагентов выведите пострадавшего на свежий воздух.
- В случае контакта с кожей или ожогов промывайте поврежденную зону большим количеством воды в течение 10 минут или дольше.
- В случае сомнений немедленно обратитесь к врачу. Возьмите с собой химический реагент и контейнер от него.
- В случае травм всегда обращайтесь к врачу.
- Неправильное использование химических реагентов может вызвать травму и нанести вред здоровью. Проводите только указанные в инструкции эксперименты.
- Данный набор опытов предназначен только для детей 12 лет и старше.
- Способности детей существенно различаются даже внутри возрастной группы. Поэтому родители, проводящие эксперименты вместе с детьми, должны по своему усмотрению решить, какие опыты подходят для их детей и будут безопасны для них.
- Родители должны обсудить правила безопасности с ребенком или детьми перед началом проведения экспериментов. Особое внимание следует уделить безопасному обращению с кислотами, щелочами и горючими жидкостями.
- Перед началом экспериментов очистите место проведения опытов от предметов, которые могут вам помешать. Следует избегать хранения пищевых продуктов рядом с местом проведения опытов. Место проведения опытов должно хорошо вентилироваться и находиться близко к водопроводному крану или другому источнику воды. Для проведения экспериментов потребуется устойчивый стол.
- Вещества в одноразовой упаковке должны быть использованы полностью или утилизированы после проведения одного эксперимента, т.е. после открытия упаковки.
Часто задаваемые вопросы
Где взять 96%-й раствор спирта (этанола)?
Спирт можно купить в аптеке или получить лабораторным методом. Для этого вам понадобятся три свечи и крепкий алкоголь или 40–60%-й раствор этанола. Остальное вы найдете в коробке «Химия растений» и стартовом наборе.
- Вставьте металлический переходник в пробку с одним отверстием.
- Наденьте на переходник силиконовую трубку.
- Вставьте воронку в колбу и налейте 40 мл крепкого алкоголя или 40–60%-го раствора этанола.
- Закройте колбу пробкой.
- Налейте в стеклянный стакан холодной воды (до середины). Опустите в стакан пробирку.
- Поставьте на горелку три свечи и зажгите их. Накройте горелку пламярассекателем.
- Поставьте колбу на пламярассекатель. Свободный конец трубки опустите в пробирку. Подождите, пока пробирка не заполнится жидкостью на две трети.
- Потушите свечи.
- Вылейте жидкость из пробирки в стаканчик с измельченными зелеными листьями и продолжайте опыт, следуя инструкции.
Другие эксперименты
Пошаговая инструкция
Хлорофилл - это вещество, которое придает листьям зеленый цвет. Он практически не растворяется в воде, но растворяется во многих органических растворителях, например, в этиловом спирте.
Когда достаточно хлорофилла растворится в спирте, возьмем два образца раствора.
В молекуле хлорофилла есть ион магния Mg 2+ (зеленый). В присутствии кислоты он легко «уходит» из молекулы. Образуется феофитин - соединение, с менее яркой и насыщенной окраской.
Освободившееся от магния место может легко занять ион меди Cu 2+ (коричневый) из соли меди CuSO 4 . Получившийся медный комплекс феофитина похож по цвету на хлорофилл.
Медный комплекс феофитина более устойчив, чем хлорофилл. Если оставить оба образца на свету, хлорофилл потускнеет и разница между веществами будет хорошо заметна.
Утилизация
Твердые отходы эксперимента утилизируйте вместе с бытовым мусором. Растворы слейте в раковину и затем тщательно промойте ее водой.
Что произошло
Для чего мы используем растворитель?
Спирт помогает извлечь хлорофилл из измельченных листьев. У молекулы хлорофилла есть длинный гидрофобный («боящийся воды») хвост, который мешает веществу растворяться в воде. Зато в спирте (или, например, в ацетоне) растворимость хлорофилла уже достаточно высока.
Узнать больше
Еще хлорофилл растворяется в жирах. Из-за этого некоторые растительные масла, например рапсовое и оливковое, часто имеют ярко выраженный зеленый оттенок. Для обесцвечивания таких масел проводят обработку щелочью. В результате молекула хлорофилла теряет гидрофобный хвост, а вместе с ним и способность растворяться в жирах.
Лучше, чем в ацетоне и спирте, хлорофилл растворяется только в жидкостях типа бензина. Но бензин не может так же эффективно извлечь пигмент из листьев. Дело в том, что в растении молекулы хлорофилла тесно связаны с белковыми молекулами. Чтобы разорвать связь с белком, в растворителе должна быть вода, которая не смешивается с углеводородами (бензином, керосином, петролейным эфиром).
Почему зелёный раствор побледнел после добавления лимонной кислоты?
Цвет раствора стал менее насыщенным, потому что в кислой среде ионы водорода H + вытеснили ионы магния Mg 2+ и хлорофилл превратился в феофитин. По сравнению с исходным веществом, феофитин имеет более темную, но в то же время менее яркую окраску.
Узнать больше
Феофитинизация - очень распространенное явление. Этим страшным словом называют процесс обесцвечивания хлорофилла за счет потери ионов магния Mg 2+ в присутствии кислот. Вы, должно быть, замечали, что при кулинарной обработке свежие зеленые овощи становятся темнее. Эффект феофитинизации особенно нагляден при мариновании огурцов: после добавления маринада ярко-зеленая кожица плодов становится буроватой.
Что происходит при добавлении CuSO 4 ?
Когда мы добавляем раствор сульфата меди CuSO 4 , в пробирке появляются ионы меди Cu 2+ . Они занимают место в молекуле хлорофилла, откуда предварительно был вытеснен магний Mg 2+ . Комплекс хлорофилла с медью имеет ярко-зеленый цвет, поэтому раствор снова приобретает выраженную зеленую окраску. Даже спустя несколько дней, когда магнийсодержащий хлорофилл уже успевает разрушиться, цвет раствора медного комплекса хлорофилла остается насыщенным.
Узнать больше
Продукт взаимодействия раствора феофитина с ионами меди Cu 2+ носит суровое название - «хлорофилла комплекс медный». Это вещество зарегистрировано под кодом E141 как разрешенный пищевой краситель. Применять такое вещество можно лишь в строго ограниченных дозах, ведь содержащаяся в нем медь - это тяжелый металл, опасный для здоровья в количествах более 5 мг в сутки. Управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов (FDA) в США позволяет использование E141 в пищу исключительно для окрашивания сухих смесей при изготовлении напитков на цитрусовой основе. При этом доля красителя должна составлять не больше 0,2 % массы сухого продукта. В Европе, России и большинстве стран Азии, Африки и Южной Америки разрешено использовать медный комплекс хлорофилла при производстве кондитерских изделий, консервированных овощей, косметических продуктов и лекарств.
Какие еще металлы могут занять место магния в хлорофилле?
Не только медь Cu 2+ может вернуть окраску подкисленному раствору хлорофилла. Соли цинка Zn 2+ и ртути Hg 2+ также образуют с хлорофиллом окрашенные в зеленый цвет соединения. Однако реакции с этими ионами проходят гораздо медленнее и требуют особых условий, а окраска комплексов с хлорофиллом получается не такой насыщенной, как с медью. Также стоит помнить, что соли ртути крайне ядовиты и совсем не предназначены для домашних экспериментов.
Почему раствор хлорофилла побледнел?
Со временем в растворе магниевого комплекса хлорофилла происходит фотохимическое окисление. Из-за этого раствор теряет свою насыщенную окраску. Медный комплекс хлорофилла же намного стабильнее своего природного предшественника. Он не подвергается окислению так быстро, и потому его раствор дольше сохраняет свой цвет.
Листья каких растений лучше всего подходят для эксперимента?
Подойдут многие свежие зеленые листья. Перед проведением опыта убедитесь, что растение не является ядовитым. Также не стоит использовать листья растений с млечным соком (молочай, одуванчик, любимый мамин фикус и другие). Чтобы проверить, есть ли в растении млечный сок, посмотрите на срез листа: выступающие белые (иногда желтые, бежевые или красноватые) непрозрачные капельки указывают на то, что такой материал для эксперимента лучше не брать. С сочными мясистыми листьями (седумы, каланхоэ, традесканции и других) раствор получится бледным, потому что в мякоти листа таких растений содержится слишком мало хлорофилла.
жит контролем. По положению темных полос в опытном спектре определяют какие лучи поглощаются исследуемым пигментом.
Цель работы: познакомиться с оптическими свойствами пигмен-
Определение спектра поглощения хлорофилла. Спектроскоп установить по отношению к свету так, чтобы все области спектра имели одинаковую яркость. В спектрофотометрическую кювету налить спиртовую вытяжку хлорофилла, поместить ее перед щелью спектроскопа и определить положение темных полос, которые соответствуют лучам, поглощаемым хлорофиллом.
Ширина полос зависит от концентрации пигмента или толщины слоя его раствора. Для наблюдения спектров поглощения растворов с разной концентрацией хлорофилла разбавить вытяжку спиртом в отношениях 1:1, 1:3, 1:5 и т.д. и исследовать оптические свойства полученных растворов. Из сравнения спектров поглощения растворов различной концентрации выясняем, что наиболее сильное поглощение происходит в красных лучах (самая концентрированная вытяжка). По окончании опыта сделать заключение о зависимости спектра поглощения хлорофилла от его концентрации и объяснить установленный факт.
Спектр поглощения каротина и ксантофилла. Для получения спектра поглощения каротиноидов пипеткой осторожно взять бензиновый раствор, в который перешли каротин и ксантофилл после омыления хлорофилла, перенести его в кювету и поместить перед щелью спектроскопа. Рассмотреть спектр поглощения и сравнить его со спектром поглощения хлорофилла. Зарисовать оба спектра.
Флуоресценция хлорофилла. Флуоресценция – испускание возбужденной молекулой хлорофилла света. Суть ее состоит в следующем. При комнатной температуре и в темноте молекула хлорофилла находится в основном состоянии, т.е. энергия ее соответствует нижнему синглетному уровню (So).: Поглощение кванта света сопровождается переходом одного из π-электронов на более высокий энергетический уровень. В результате возникает синглетное электронно-возбужденное состояние молекулы. Синглетным называется такое возбужденное состояние, при котором переход электрона на более высокий энергетический уровень не сопровождается изменением знака спина. В спектрах поглощения ему соответствует одна линия. Если при этом поглощается квант красного света, то электрон переходит на первый синглетный уровень (S1 ) с энергией 1,7 эв и временем жизни 10–8 –10–9 с. В случае захвата кванта синего света электрон оказывается на втором синглетном уровне (S2 ) с энергией 2,9 эв, а время жизни такого состояния уменьшается до 10–12 –10–13 с. Однако независимо от того, в какое элек-
тронно-возбужденное состояние молекула была переведена поглощенным квантом, она, в конечном счете, переходит на низший колебательный подуровень первого синглетного возбужденного состояния (S1 ). Энергия этого состояния может использоваться на осуществление фотохимических процессов, мигрировать от одной молекулы хлорофилла к другой, растрачиваться в виде тепла или флуоресцентного излучения.
Таким образом, независимо от длины возбуждающего света хлорофилл флуоресцирует только в красной части спектра. Уменьшение энергии кванта, излученного возбужденной молекулой, по сравнению с энергией поглощенного кванта получило название стоксового сдвига. Флуоресцируют только хлорофилл «а» и хлорофилл «b»; каротиноиды не обладают этой способностью. В живом листе основным флуоресцирующим пигментом является хлорофилл «а». При этом в листьях флуоресценция выражена гораздо слабее, чем в растворе, так как часть поглощенной энергии используется на сенсибилизирование фотохимических реакций. Поэтому возрастание интенсивности фотосинтеза, как правило, влечет за собой ослабление флуоресценции. Флуоресценция не только дает ценные сведения об использовании энергии в фотохимических процессах, но и является важной характеристикой взаимодействия молекул различных пигментов в ламеллах тилакоидов хлоропласта, миграции энергии в фотосистемах и т.д.
Ход работы . Для определения флуоресценции спиртовую вытяжку пигментов или раствор хлорофилла в бензине, полученный при разделении пигментов по Краусу, поместить на темную бумагу у
Рис.10. Рассмотрение спиртовой вытяжки хлорофилла:
А – в отраженных лучах; Б – в проходящих лучах; а – источник света; б – пробирка с вытяжкой; в – глаз; г – падающие лучи; д, е
– отраженные лучи; ж – лучи, прошедшие через хлорофилл
источника освещения и рассмотреть в отраженном свете (рис. 10). Вытяжка хлорофилла будет темно-красного цвета.
Флуоресценцию можно наблюдать и в живом листе. Для этого берут элодею канадскую (Elodea canadensis Michx.), помещают объект на предметный столик микроскопа и освещают синефиолетовыми лучами, под действием которых зеленые пластиды начинают светиться красным светом.
Материалы и оборудование: 1) спиртовая вытяжка пигментов листа; 2) раствор каротина и ксантофилла (бензиновый слой, полученный после омыления хлорофилла); 3) пипетки на 1 мл; 4) кюветы; 5) спектроскопы.
3.3. Разделение пигментов методом бумажной хроматографии
Предлагаемый метод позволяет частично разделить на бумаге пигменты пластид. Полное разделение пигментов можно получить с помощью специальной хроматографической бумаги при использовании нескольких растворителей.
В настоящей работе разделение пигментов основано на различном продвижении их с растворителем, что обусловлено различной адсорбирующей способностью пигментов на бумаге и частично разной растворимостью их в бензине.
Цель работы: провести полное разделение смеси пигментов на отдельные компоненты, применяя двумерную хроматограмму.
Ход работы: 1. Приготовить ацетоновую вытяжку из свежих листьев растений. Навеска растительного материала должна составлять 2-3 г, объем ацетоновой вытяжки пигментов – 25 мл (100%-й ацетон).
2. Из хроматографической бумаги вырезать полоску шириной 1,5- 2,0 см и длиной 20 см. Держа бумажную полоску вертикально, кончик
ее опустить на несколько секунд в вытяжку пигментов, налитую в бюкс или фарфоровую чашку. При кратковременном погружении вытяжка поднимается по бумаге на 1,0-1,5 см (стартовая линия). Затем бумагу высушивают в токе воздуха и снова погружают в раствор пигментов. Эту операцию проводят 5-7 раз.
3. После этого нижний конец бумажной полоски на несколько секунд опустить в чистый ацетон, чтобы все пигменты поднялись на 1,0- 1,5 см. Таким образом, на хроматографической бумаге получают окрашенную зону (в виде зеленой полоски), где сконцентрирована смесь пигментов, которая должна быть разделена.
4. Хорошо высушив полоску бумаги в токе воздуха (до исчезновения запаха ацетона), помещают ее в строго вертикальном положении в цилиндр, на дно которого налит бензин с точкой кипения 80-1200 С, так чтобы растворитель не касался зоны пигментов. Цилиндр герметически закрывают хорошо подобранной пробкой. Через 15 мин растворитель поднимается на 10-12 см. Смесь пигментов при этом разделяется на от-
дельные компоненты в виде по-
лос, которые располагаются в |
|||||
следующем | порядке: первый |
||||
снизу хлорофилл «b», над ним |
|||||
хлорофилл «а», затем ксанто- |
|||||
передвигается |
|||||
с фронтом | растворителя |
||||
быстрее других компонентов, и |
|||||
зона его на бумаге располагается |
|||||
Рис. 11. Распределение пигментов | других пигментов |
||||
(рис. 11). Сделать рисунок. |
|||||
на бумаге |
|||||
Материалы и оборудование: 1) листья растений; 2) ацетон; 3) бензин; 4) вазелин; 5) бюксы или фарфоровые чашки; 6) фарфоровые ступки с пестиками; 7) воронки; 8) стеклянные палочки; 9) фильтры бумажные; 10) полоски хроматографической бумаги; 11) высокие стаканы или цилиндры; 12) ножницы.
3.4. Определение содержания каротина в корнеплодах моркови
Для выполнения этой работы используют фотометрический метод. Он основан на переведении определяемого компонента в растворе в соединение, поглощающее свет, и измерении светопоглощения полученным соединением.
Если на кювету с окрашенным раствором направить световой поток, то часть его будет поглощена, а другая пройдет через раствор. По-
глощение будет зависеть от количества молекул, встретившихся на пути светового потока.
При работе нужно выбрать тот светофильтр, который пропускал бы лучи, поглощаемые раствором: максимум пропускания светофильтра должен совпадать с максимумом поглощения раствора. Светофильтры на ФЭКе установлены с разной длиной волны в области максимума пропускания. Для измерения их подбирают по принципу дополнительного цвета: при работе с желтоокрашенным соединением – синий, с синим соединением – красный и т.д.
Кюветы характеризуются рабочей длиной (расстояние между гранями, которое указывается на стенке, обращенной к проходящему свету): 5, 10, 20, 30, 50 мм. При анализе слабоокрашенных растворов берут кюветы с большей рабочей длиной, сильноокрашенных – с меньшей. Стремятся, чтобы отсчеты получались по шкале оптической плотности не более 0,8.
Цель работы: определить количество каротина в корнеплодах моркови.
Ход работы : 1. Навеску моркови (1 г) мелко нарезать и растереть в ступке с песком и 0,3 г СаО (для отнятия во ды) до однородной массы. В ступку добавить небольшими порциями растворитель
– ацетон и продолжить растирание. Полученный экстракт слить в мерную колбу на 25 мл. По окончании экстракции колбу долить растворителем до метки. Если раствор каротина получился мутный, его фильтруют.
2. В качестве стандарта используют раствор азобензола (он соответствует 0,00235 г каротина на 1 мл раствора).
3. После получения опытного и стандартного растворов приступить к их колориметрированию. Для этого в одну кювету наливают опытный раствор, в другую – стандартный раствор и колориметрируют на ФЭКе при синем светофильтре. Расчет производят по формуле:
(К Д1 | V 100) | |||
где X – количество каротина в мг на 100 г моркови;
К – количество каротина для стандарта (0,00235 г); V – объем раствора в мл (25 мл);
Д1 – оптическая плотность для раствора каротина; Д2 – оптическая плотность для стандарта.
4. Определяют суточную потребность человека в моркови, исходя из нормы 5 мг каротина в сутки.
Материалы и оборудование: 1) корнеплод моркови; 2) ацетон; 3) раствор азобензола; 4) колбы на 25 мл; 5) фарфоровые ступки с пестиками; 6)
фильтры; 7) воронки; 8) фотоэлектроколориметр с кюветами; 9) стеклянные палочки.
3.5. Определение интенсивности фотосинтеза методом ассимиляционной колбы (по Л.А. Иванову и Н.Л. Коссович)
Метод основан на определении количества диоксида углерода, поглощенного листьями при фотосинтезе. Побег или отдельный лист помещают в перевернутую вверх дном стеклянную колбу (рис. 12) и выставляют на свет на 15-20 минут. Часть содержащегося в колбе диоксида углерода потребляется в процессе фотосинтеза. Затем связывают не поглощенную листьями СО2 , наливая в колбу некоторый избыток раствора щелочи. После чего оставшуюся щелочь титруют соляной или щавелевой кислотой. То же самое проделывают с контрольной колбой (без растения) и сопоставляют результаты титрования.
Рис. 12. Прибор Л.А. Иванова и Н.Л. Коссович для определения интенсивности фотосинтеза: а – колба; б – стержень с листом; в – пробка
Если опытная и контрольная колбы имеют равный объем и если в обе колбы налито одинаковое количество раствора Ва(ОН)2 , то количество поглощенного растением диоксида углерода будет прямо пропорционально разности результатов титрования содержимого этих колб. Для того чтобы установить, какому количеству СО2 соответствует 1 мл используемой для титрования кислоты, сопоставим реакции, в которые вступает прилитая в колбу щелочь:
Ва(ОН)2 + СО2 = ВаСО3 ↓ + Н2 О,
Ва(ОН)2 + 2HCI = ВaCI2 + 2Н2 О.
1М HCl соответствует 0,5М СО2 , т.е. 44: 2 = 22 г СО2 . При концентрации 0,025Н HCI в 1 мл этого раствора содержится
0,000025М HCI, что эквивалентно 22×0,000025=0,00055 г или 0,55 мг СО2 . Данный метод дает достаточно точные результаты лишь в
том случае, если все операции по открыванию и закрыванию колб проводить, не прикасаясь к стеклу руками (в противном случае воздух, расширяясь при нагревании, будет частично выходить из колб).
Цель работы: определить интенсивность фотосинтеза растений.Ход работы : 1. Взять две одинаковые колбы и выдержать их в
одинаковых условиях открытыми в течение 10-20 минут для заполнения воздухом. Затем одновременно вставить в них пробки с отверстиями, закрытыми стеклянными пробками (№1), не допуская нагревания колб прикосновением рук.
2. Срезать лист или побег растения, обновить срез бритвой под водой и поставить в заполненную водой (воду берут кипяченую, чтобы не было пузырьков воздуха) пробирку, прикрепленную к палочке, вставленной в пробку (№2).
3. Быстрым, но спокойным движением вынуть из колбы пробку №1 и вставить пробку №2 (с растением).
4. Выставить колбу на свет и отметить время начала опыта. Во время опыта следить за температурой внутри колбы и в случае перегрева охлаждать колбу водой. Особенно важно, чтобы в конце опыта температура была такой же, как и вначале, иначе воздух может войти
в колбу или выйти из нее. Продолжительность опыта должна быть такой, чтобы листья успели поглотить не бо лее 25% содержащего-
ся в колбе СО2 . При хорошем освещении для колбы вместимостью 1 л экспозиция не должна превышать 5 минут, для более крупных колб
– 15-20 минут.
5. По окончании опыта извлечь из колбы растение и быстро закрыть ее пробкой № 1, отметив время. Контрольную колбу также приоткрыть на несколько секунд. Налить в колбы через отверстие в пробке по 25 мл
0,025Н раствора Ва(ОН)2 и по 2-3 капли фенолфталеина и немедленно закрыть отверстие пробкой.
Таблица 8 |
|||||||||
Интенсивность фотосинтеза | |||||||||
Расход HCl, мл | Интенсив- |
||||||||
прилитого | |||||||||
фотосинте- |
|||||||||
дм2 | Ва(ОН)2 , | за, мгСО2 / |
|||||||
6. Для увеличения поверхности соприкосновения Ва(ОН) 2 с воздухом, осторожно смачивать этим раствором стенки колб и в
течение 3 минут периодически взбалтывать, после чего через отверстие в пробке проводят титрование 0,025Н раствором соляной кислоты до исчезновения розового окрашивания.
7. Определить площадь листа методом квадратов. Результаты за-
писать в таблицу 8. | ||||
Интенсивность фотосинтеза J ф (мл СО2 /г | час) вычисляют по |
|||
(А В )К | ||||
где А – количество HCI, пошедшее на титрование барита в опытной колбе, мл;
В – количество HCI, пошедшее на титрование барита в контрольной колбе, мл;
К – поправка к титру HCI;
0,55 – число мг СО2 , соответствующее 1 мл 0,025Н НС1; S – площадь листьев, дм2 ;
t – экспозиция, мин;
60 – коэффициент перевода минут в часы.
Материалы и оборудование: 1) листья или побеги растений; 2) 0,025Н раствор Ва(ОН)2 ; 3) 0,025Н раствор HCI; 4) фенолфталеин; 5) конические колбы емкостью 1 л (2 шт.); 6) бумага; 7) резиновые пробки (3 шт.); 8) две пробки с отверстием, закрытым стеклянной пробкой, в третью пробку вставлена стеклянная или металлическая палочка с привязанной к ней маленькой пробиркой и термометром; 9) штатив для установки колбы в перевернутом положении; 10) электрическая лампа 200-300 Вт; 11) ножницы; 12) бумага; 13) весы с разновесами.
1. Космическая роль зеленых растений. Значение работ К.А. Тимирязева.
2. Пигменты фотосинтезирующих растений. Методы разделения пигментов.
3. Химические и оптические свойства пигментов.
4. Физико-химические свойства молекулы хлорофилла. Флуоресценция хлорофилла.
5. Световая стадия фотосинтеза. Фотосинтетическое фосфорилирование.
6. Темновая стадия фотосинтеза. Цикл Кальвина, цикл ХетчаСлэка, фотосинтез по типу толстянковых.
7. Интенсивность фотосинтеза, фотодыхание.
8. Влияние экологических факторов на интенсивность фотосинте-
4. ДЫХАНИЕ РАСТЕНИЙ
История развития учения о дыхании. Теория окисления и восстановления: А.Н. Баха, В.И. Палладина, Г. Виланда, О. Варбурга, С.П. Костычева и др. Классификация ферментных систем дыхания. Строение ферментов. Действие активаторов и ингибиторов. Характеристика дегидрогеназ, оксидоредуктаз, оксидаз. Механизмы действия каталазы, пероксидазы, цитохромоксидазы и полифенолоксидазы.
Физиологическая роль дыхания. Специфика дыхания у растений. Митохондрии. Их структура и функции.
Пути окисления органических веществ в клетке. Унификация суб-
стратов дыхания. Механизм активации дыхательных субстратов, пути их включения в процессы биологического окисления. Основные пути диссимиляции углеводов. Пентозомонофосфатный путь окисления глюкозы. Гликолитический путь окисления (гликолиз), основные стадии. Цикл Г. Кребса, последовательность протекания реакции. Глиоксилатный цикл.
Электрон-транспортная цепь митохондрий: структурная организация, основные компоненты, их окислительно-восстановительные потенциалы. Комплексы переносчиков электронов. Альтернативность каталитических механизмов биологического окисления (цианид-резистентное дыхание). Внемитохондриальные окислительные системы.
Окислительное фосфорилирование. Энергетика дыхания: фосфаты и тиоэфиры. Единство элементарных энергетических процессов в живой природе. Фосфорилирование на уровне субстрата (субстратное) и фосфорилирование в дыхательной цепи (коферментное). Теории окислительного фосфорилирования: химическая, механо-химическая (теория Бойера), хемиосмотическая (теория Митчела). Основные положения хемиосмотической теории сопряжения Митчела. Мембрана как структурная основа биоэнергетических процессов. Трансформация энергии на сопрягающих мембранах. Электрохимический потенциал – движущая сила фосфорилирования. Регуляция электронного транспорта и фосфорилирования. Разобщение дыхания и фосфорилирования. Влияние на этот процесс факторов среды.
Дыхание как центральное звено обмена веществ. Значение дыхания в конструктивном метаболизме клетки и его связь с другими функциями клетки.
Количественные показатели газообмена (поглощение кислорода, выделение углекислоты, дыхательный коэффициент и др.). Эффект Л. Пастера.
Регуляция дыхания. Экология дыхания. Зависимость дыхания от внешних и внутренних факторов.
4.1. Газометрическое определение каталазы
Многие окислительно-восстановительные процессы в растительных тканях идут с участием ферментов.
Метод определения активности фермента основан на способности каталазы разлагать перекись водорода с выделением газообразного кислорода. Поскольку количество перекиси водорода, подвергнувшейся разложению, зависит от активности фермента, оказывается возможным по количеству кислорода и скорости его выделения судить об активности каталазы.
2Н2 О2 → 2Н2 О + О2 .
Цель работы: определение активности фермента каталазы в растительном материале.
Ход работы : 1. Взять навеску листьев или частей растения массой 4 г, добавить 0,2 г мела (для придания щелочной реакции), щепотку песку и тщательно растереть в ступке с небольшим количеством дистиллированной воды. Растертую массу по воронке перенести в мерную колбу на 100 мл и довести ди-
стиллированной водой до метки. 2. Колбу с растительным экс-
трактом оставить стоять на 15 минут. В это время приготовить все части прибора каталазиметра (рис. 13) для определения активности каталазы и проверить его герметичность.
3. По истечении 15 минут, из колбы с помощью мерной пипетки взять 10 мл экстракта вместе со взвесью и перенести в одно отделение реакционного сосуда (каталазника). В другое отделение со-
Рис. 13. Каталазиметр суда поместить 5 мл перекиси водорода. Реакционный сосуд
подсоединить к остальной части прибора каталазиметра.
Соединения металлов с ковалентными связями в апротонных растворителях изменяют свои свойства и диссоциируют, а затем образуют комплексные соединения, например : Интересен процесс растворения TiCl4 в диметилформамиде (ДМФА) и диметилсульфоксиде (ДМСО). Молекулы растворителя взаимодействуют с титаном....Хлорофилл
(Процессы комплексообразования природного и техногенного происхождения)Биосинтез хлорофилла
(Процессы комплексообразования природного и техногенного происхождения)(Процессы комплексообразования природного и техногенного происхождения)
Хлорофилл
Понятие хлорофилл происходит от греческих слов (х^сорбс; - зелёный и (poAXov- лист). Это зеленый пигмент растений, с помощью которого происходит поглощение солнечного света и процесс фотосинтеза. Тимирязев был одним из первых исследователей, обративших внимание на хлорофилл. Это - группа сложных...(Процессы комплексообразования природного и техногенного происхождения)
Биосинтез хлорофилла
В природе за биосинтез хлорофилла несут ответственность центры биосинтеза- полиферментные комплексы. Процесс биосинтеза нагляден. На последней стадии биосинтеза у высших растений происходит превращение слабоокрашенного протохлорофиллида под действием света в хлорофилл. Процесс протекает за несколько...(Процессы комплексообразования природного и техногенного происхождения)
Физико-химические свойства хлорофилла
Хлорофилл а имеет высокую молекулярную массу 893,52. При температуре 117-120 °С черно-голубые микрокристаллы хлорофилла плавятся. Хлорофилл а растворяется в диэтиловом эфире, этаноле, ацетоне, бензоле, хлороформе b пиридине. Его растворы имеют сине- зеленую окраску и сильно флуоресцируют....(Процессы комплексообразования природного и техногенного происхождения)
Цель: ознакомить с порядком выполнения работы; сделать вывод о химических свойствах пигментов листа.
Теоретические сведения. Пигментная система хлоропласта представлена двумя типами пигментов: зелеными – хлорофиллами а и b и желтыми – каротиноидами. Основной функциональный пигмент – хлорофилл а , служит непосредственным донором энергии для фотосинтетических реакций, остальные пигменты лишь передают ему поглощенную энергию.
Ход работы:
Получение спиртового раствора (вытяжки) пигментов. Пигменты из растительной ткани извлекают полярными растворителями (этиловый спирт, ацетон), которые разрушают связь хлорофиллов и ксантофиллов с липопротеидами пластид и обеспечивают их экстрагирование. Сухие листья помещают в коническую колбу на 200 мл и ошпаривают кипятком, затем воду сливают. В колбу приливают 100 мл этилового спирта, закрывают ее корковой пробкой с обратным холодильником и ставят на баню с кипящей водой для экстрагирования пигментов. После пятиминутного кипячения содержимое колбы охлаждают и осторожно сливают в другую колбу. Экстракт используют в последующих опытах.
Разделение пигментов по Краусу. Метод основан на различной растворимости пигментов в спирте и бензине. Указанные растворители в одном сосуде не смешиваются, а образуют две фазы – верхнюю бензиновую, нижнюю спиртовую, благодаря чему компоненты смеси пигментов разделяются.
В пробирку наливают 2-3 мл спиртового экстракта пигментов, и 3-4 мл бензина. Содержимое пробирки встряхивают, закрыв ее пробкой или большим польцем, и отстаивают. По мере расслоения эмульсии бензиновый слой окрашивается в зеленый цвет из-за лучшей растворимости в нем хлорофилла. В бензин переходит и каротин, но его окраска максируется хлорофиллом. Ксантофилл остается в спиртовом слое золотисто-желтой окраски.
Если пигменты не разделяются, добавляют три- четыре капли воды и снова встряхивают. При избытке воды возможно помутнение нижнего слоя. В этом случае следует прилить немного этилового спирта и взболтать пробирку.
Зарисовывают картину распределения пигментов и делают выводы.
Омыление хлорофилла щелочью. Обрабатывая хлорофилл щелочью, можно вызвать омыление эфирных групп, т.е. отщепление остатков метилового спирта и фитола:
Образующаяся при этом соль хлорофиллиновой кислоты сохраняет зеленую окраску и оптические свойства хлорофилла, но отличается от него большей гидрофильностью.
В пробирку с 2-3 мл спиртового раствора пигментов приливают 1 мл 20%-ного раствора NaОН и взбалтывают. Пробирку ставят на кипящую водяную баню. Как только раствор закипит, пробирку вынимают и охлаждают, затем добавляют равный объем бензина и несколько капель воды. Содержимое пробирки резко встряхивают и отстаивают. В бензиновый слой переходят каротин и ксантофилл, а в спиртовой - натриевая соль хлорофиллиновой кислоты. Зарисовывают окраску слоев, указывая распределение пигментов.
Получение феофитина и обратное замещение водорода атомом металла. Атом магния сравнительно слабо удерживается в порфириновом ядре хлорофилла и при осторожном воздействии сильных кислот легко замещается двумя протонами с образованием феофитина бурого цвета:
Если на феофитин действовать солями меди, цинка или ртути, то вместо двух протонов в ядро входит соответсвующий металл и продукты реакции окрашиваются в зеленый цвет. Однако полученная окраска несколько отличается от окраски хлорофилл:
Следовательно, цвет хлорофиллов обусловлен металлорганической связью в их молекулах. Обратное введение магния в феофитин сильно затруднено. В две пробирки берут по 2-3 мл спиртовой вытяжки пигментов и добавляют по одной – две капли 10%-ной раствора соляной кислоты. При взбалтывании зеленая окраска хлорофилла переходит в бурую, характерную для феофитина. Одну пробирку с феоситином оставляют для контроля, а во вторую вносят несколько кристаллов ацетата меди и нагревают раствор на водяной бане до кипения. По мере нагревания бурый цвет раствора меняется на зеленый в результате образования хлорофилло подобного производного меди.
Зарисовывают окраску феофитина и медьпроизводного хлорофилла.
Оборудование: Сухие или сырые листья, этиловый спирт, бензин, 20% -ный раствор NаОН, 10%-ный раствор соляной кислоты в капельнице, ацетат меди. Конические колбы с обратным холодильником, водяные бани, штативы с пробирками, пипетки на 1 мл, конические колбочки, цветные карандаши.
Литература: 1, с. 63-66
Контрольные вопросы:
1 Какава роль хлорофилла в процессе фотосинтеза?
2 Какава роль каратиноидов в процессе фотосинтеза?
3 Каков механизм приобразавания энергии света в химическую энергию?
