Propiedades físicas y químicas del ADN.
| Nombre del parámetro | Sentido |
| Tema del artículo: | Propiedades físicas y químicas del ADN. |
| Rúbrica (categoría temática) | Deporte |
1. Desnaturalización
La desnaturalización del ADN se lleva a cabo bajo la acción de factores químicos (urea, cloruro de guanidina, ácido, álcali) y factores físicos (temperatura). Como resultado de la desnaturalización, se destruye la estructura secundaria del ADN. Cuando se elimina el impacto del factor desnaturalizante, se debe restaurar la estructura secundaria del ADN. Este proceso se llama renaturalización.
La desnaturalización o fusión del ADN va acompañada de un aumento de la densidad óptica de las soluciones de ADN a una longitud de onda de 260 nm. Este fenómeno se denomina efecto hipercrómico. El aumento máximo en la densidad óptica de una solución de ADN durante su descomposición completa a mononucleótidos en la longitud de onda especificada es de aproximadamente el 80 %.
Una molécula de ADN que consta únicamente de poli-d(AT) se funde a temperaturas más bajas que una molécula de ADN que consta de poli-d(GC). Esto se debe al hecho de que se forman dos enlaces de hidrógeno entre A y T, y tres enlaces de hidrógeno entre G y C.
2. Punto de fusión
La característica más importante del ADN es su temperatura de fusión, que corresponde a la temperatura a la cual el aumento de la densidad óptica de una solución de ADN es igual a la mitad de su aumento máximo observado durante la desnaturalización completa del ADN. La temperatura de fusión del ADN que consta de poli-d(AT) es de 66 o C, el ADN que consta de poli-d(GC) es de 85 o C. El ADN natural tiene un punto de fusión de más de 66 o C, pero menos de 85 o C, porque incluyen las cuatro bases nitrogenadas, pero en diferentes proporciones en diferentes organismos vivos. Entonces, el ADN humano se caracteriza por un punto de fusión igual a 81 - 82 o C, E. coli - 90,5 o C.
Cuando la solución de ADN se enfría (hibrida), la estructura secundaria original del ADN se puede restaurar de acuerdo con el principio de complementariedad.
3. hibridación
Si una mezcla de diferentes moléculas de ADN se funde inicialmente y luego se recoce, entonces si hay una similitud en sus estructuras primarias, es posible la hibridación entre las moléculas de ADN.
Figura - Hibridación entre diferentes moléculas de ADN
Cuanto mayor sea la similitud entre las moléculas de ADN, mayor será el grado de hibridación. Con base en los resultados de la hibridación entre el ADN de diferentes especies de organismos vivos, se puede juzgar su relación. Cuanto mayor sea el grado de hibridación, más estrecha será la relación entre las especies analizadas.
La hibridación también es posible entre moléculas de ADN y ARN, siempre que existan secuencias de nucleótidos homólogas.
Figura - Hibridación entre ADN y ARN
4. Los ácidos nucleicos absorben fuertemente la luz ultravioleta y esta propiedad es la base de la determinación de su concentración. El efecto mutagénico de la luz ultravioleta también está asociado con la misma propiedad.
organización del ADN eucariótico
La longitud de la molécula de ADN eucariótico es muchas veces mayor que el tamaño de la célula. Para garantizar el flujo de varios procesos biológicos, debe envasarse adecuadamente. Hay varios niveles de su compactación.
1. ADN desnudo - es una doble hélice, su diámetro es de 1,8 nm˸
Dicho ADN es hipersensible a las ADNasas, enzimas que hidrolizan los enlaces fosfodiéster.
Propiedades físicas y químicas del ADN - concepto y tipos. Clasificación y características de la categoría "Propiedades físicas y químicas del ADN" 2015, 2017-2018.
estructura del ADN
formas de ADN
composición de nucleótidos del ADN
Fusión de ADN
topología del ADN
El ADN es una molécula que consta de dos moléculas antiparalelas conectadas por enlaces de hidrógeno según el principio de complementariedad con la formación de una estructura helicoidal.
estructura del ADN
La unidad estructural de la cadena de ADN es el desoxirribonucleósido, que consta de fosfato, azúcar desoxirribosa y cuatro nucleótidos: adenina (A), citosina (C), guanina (G) y timina (T). En algunos fagos, la timina se reemplaza por uracilo (fago PBS1), que generalmente se incluye en el ARN. Los nucleótidos de dos hebras de ADN están conectados por puentes de hidrógeno según el principio de complementariedad: A-T, G-C purinas (2 anillos) -Adenina, Guanina pirimidinas -Timina, Citosina |
ADNd=20A; - para purina-12A, para pirimidina-8A |
En el par A-T hay 2 enlaces H, en el par G-C hay 3 |
Molécula de ADN giratoria
Tautomería básica
En los heterociclos, los protones unidos al nitrógeno pueden pasar
en otros átomos de nitrógeno o en átomos de oxígeno del grupo ceto, y en soluciones habrá un equilibrio de varias estructuras tautoméricas que se transforman rápidamente unas en otras.
Como resultado de las transformaciones tautoméricas, U y G en forma de enol pueden imitar a C y A durante el apareamiento, mientras que C y A en forma de imino pueden imitar a U y G, lo que puede conducir a mutaciones en el ADN (Fig.).
Interacción de replanteo
Las bases en la cadena de ADN se encuentran una encima de la otra en una pila, lo que proporciona una estabilización adicional de la interacción cadena - apilamiento.
El valor de la interacción de apilamiento entre bases: purina-purina>pirimidina-purina>pirimidina-pirimidina
En los oligonucleótidos y polinucleótidos, el apilamiento entre bases adyacentes conduce a la formación de una estructura helicoidal monocatenaria estable (poliA), mientras que la ausencia de apilamiento conduce a una espiral desordenada (poliU)
Energía de las interacciones de apilamiento ~ -3 - -15 kcal/mol
El esqueleto de azúcar-fosfato fuera de la base dentro de los fosfatos de desoxirrobosa está conectado por enlaces fosfodiéster. Los grupos OH del fosfato están conectados
con un grupo OH en los carbonos 3" y 5" de la desoxirribosa.
El desajuste puede ocurrir cuando la timina está en forma de enol o la citosina está en forma de imino.
Modificaciones de nucleótidos
Figura 1 nucleótidos modificados[Cantante].
Los nucleótidos del ADN pueden sufrir modificaciones: 5-metilcitosina,
5-hidroximetilcitosina, 5-hidroximetiluracilo,
N-metiladenina. En el ADN de algunos bacteriófagos, los mono o disacáridos se unen al grupo hidroximetilo de la hidroximetilcitosina a través de un enlace glucosídico. El ADN de la mayoría de los eucariotas e invertebrados inferiores contiene relativamente poca 5-metilcitosina y
N6-metiladenina. En los vertebrados, la metilación de bases juega
un papel importante en la regulación de la expresión génica, siendo la 5-metilcitosina la más común. Demostrado, que
más del 95% de los grupos metilo en el ADN de los vertebrados están contenidos en los residuos de citosina de dinucleótidos CG raros, y más del 50% de estos dinucleótidos están metilados. En las plantas, la 5-metilcitosina se puede encontrar en los dinucleótidos CG.
y trinucleótidos CNG (N – C, A o T).
Formas de ADN
| Opciones | forma de B | Una silueta | en forma de C | forma de Z |
| espiral | diestro | diestro | diestro | zurdo |
| unidades repetir | lun 1 | 1 mes | 1 mes | 2 meses |
| lunes en circulación | 10,4 | 10,7 | 9.3 | 12 |
| diámetro | 23.7A | 25.5A | 18.4A | |
| rotación/mes | 35,9 | 33,6 | 38,7 | 60/2 |
| inclinación de mon al eje | -1,2 | +19 | -9 | |
| rast. m-y mon a lo largo del eje | 0,332 nm | 0,23 nm | 0,38nm | |
| longitud de giro | 34A | 28A | 31A | 34.4A |
En el estudio del ADN por varios métodos, se encontró la presencia de varias formas de ADN formadas bajo varias condiciones (concentraciones de sal, humedad), algunas de las cuales son capaces de existir en los organismos vivos.
Hay familias A, B, C, D, T de formas de ADN, que se pueden subdividir en diferentes subtipos (C", C"").
B-ADN- el estado básico del ADN que se muestra en cristales y en soluciones acuosas.
C-ADN- la forma que existe a una concentración reducida de Na y una humedad de 44-66%, si GC=31-72%.
ADN-A- esta forma se forma en híbridos de ADN-ARN, por lo tanto, durante la transcripción, el ADN pasa a la forma A, en el sitio de contacto ARN-pol. Esta forma se caracteriza por la presencia de un vacío interno con un diámetro de 5A.
Z-ADN- forma levógira La transición B-->Z se ve facilitada por la presencia de la secuencia GC-5", que es el sitio de metilación en los organismos. Tales secuencias en los plásmidos durante el superenrollamiento cambian de la forma B a la Z.
En la transición B-->Z, la sección de 11 pb tiene una forma de transición entre la hélice izquierda y derecha.
Se encontró Z-DNA en interbandas de cromosomas politénicos de D. melanogaster.
El polinucleótido GC-5”, al estar en forma B, forma nucleosomas a bajas concentraciones de sal. A altas concentraciones de sal, el polinucleótido GC-5” pasa a la forma Z, que no forma nucleosomas.
Las formas A, Z no pueden existir en una solución acuosa sin influencias adicionales (proteínas, superenrollamiento).
D-ADN- Regiones ricas en AT del ADN del fago T2, en las que la citosina se reemplaza por 5"-hidroximetilcitosina, el único ADN natural conocido está en forma D. Además, el ADN del fago está glicosilado en más del 70%.
La doble hélice de D-DNA está más retorcida que la de B-DNA y tiene un pequeño surco profundo, una cavidad conveniente para el agua y los cationes.
Estructuras de ADN 3D
curvatura del ADN
Composición de nucleótidos del ADN
Reglas de carga
La composición de nucleótidos del ADN de algunos
organismos[Cantante].
| Una fuente | Y | GRAMO | C | T | A+T/G+C | A+G/T+C | G+C, % molar |
| bacteriófago λ bacteriófago T2 Escherichia coli Bacillus subtilis Virus del papiloma de Shoup Saccharomyces cerevisiae clamidomonas Polluelo Ratón Vaca Trigo |
26,0 32,5 23,8 29,0 26,6 31,3 19,6 27,9 28,9 27,3 27,2 |
23,8 18,2 26,0 20,7 24,5 18,7 30,2 21,2 21,1 22,5 22,6 |
24,3 16,72 26,4 21,3 24,2 17,1 30,0 21,5 20,3 22,5 22,8 |
25,8 32,6 23,8 29,0 24,7 32,9 |
1,08 1,86 0,91 1,38 1,05 1,79 0,65** 1,34** 1,44** 1,22** 1,20** |
0,99 1,03* 0,99 0,99 1,04 1,00 0,99** 0,96** 1,00** 0,99** 0,99** |
48 35* 52 42 49 36 60** 43** 41** 44** 45** |
* 5-hidroximetilcitosina
** incluyendo 5-metilcitosina
En eucariotas, la frecuencia de aparición de 5"-CG-3" es mayor que la de 5"-GC-3", porque el dinucleótido 5"-GC-3" sufre metilación implicada en la regulación de la expresión génica. En procariotas, la relación 5'-CG-3'/5'-GC-3' es casi aleatoria (ver tabla).
Tamaño de las moléculas de ADN
El tamaño del ADN se expresa en pares de bases (pb) o miles de pares de bases (pb)
| Una fuente | M, si | Largo | Lun | tipo de estructura |
| Bacteriófago φX174 SV40 bacteriófago T2 Cromosoma de Hemophilus influenzas cromosoma de Escherichia coli Saccharomyces cerevisiae cromosoma 1 cromosoma 12 Drosophila melanogaster cromosoma 2 cromosoma 3 cromosoma 4 |
1,6 10 6
3,5 10 6 1,2 10 8 7,9 10 8 2,6 10 8 1,4 10 8
4 10 10
|
1,6 micras 1,1 micras 50 micras 300 micras 1 milímetro 50 micras 15mm |
5 10 3
5,2 10 3 2 10 5 1,2 10 6 4 10 6 2,1 10 5
6,0 10 7
|
Hebra simple circular Hilo doble circular Hilo doble lineal desconocido Hilo doble circular Hilo doble lineal Hilo doble lineal |
Fusión de ADN
desnaturalización o derritiendo- divergencia de las hebras de ADN cuando el ADN se calienta a ~1000C o cuando aumenta el pH.
La divergencia de las cadenas se produce debido a la destrucción del hidrógeno débil.
enlaces e interacciones planares entre bases.
La desnaturalización también se ve afectada por: iones de metales monovalentes y divalentes, proteínas que neutralizan las cargas negativas de los grupos fosfato.
El punto de fusión de GC es más alto que AT. Para romper dos enlaces H de pares AT, se requiere menos energía que para romper tres enlaces H de pares GC; los valores de temperatura y pH a los que se produce la desnaturalización dependen de la composición de nucleótidos del ADN.
curva de fusión de ADN
La desnaturalización es un proceso reversible, la posterior restauración de la estructura del ADN de doble cadena puede ocurrir incluso con una divergencia completa de las cadenas. El proceso de reunificación, llamado renaturalización, reasociación o recocido, ocurre cuando
caída de temperatura o pH
Con una disminución brusca de la temperatura o del pH, la correcta reunión de las cadenas complementarias se dificulta debido al apareamiento.
bases de regiones localmente complementarias dentro de la misma o diferentes cadenas.
La renaturalización del ADN ocurre a una temperatura ~200C por debajo del punto de fusión.
Durante la renaturalización, las secciones de la cadena con ADN repetido se conectan primero y luego con secciones únicas.
curva de renaturalización del ADN
t fundido versus conc. sal
propiedades del ADN
El ultrasonido corta el ADN en fragmentos iguales de aproximadamente 500 pb de longitud.
El ADN es insoluble en disolventes no polares.
El álcali hidroliza el ADN.
Debido a la carga de los grupos fosfato, el ADN tiene carga negativa.
Topología de las moléculas de ADN
Literatura:
- Singer: Genes y genomas v.1
- Zenger.V: Principios de la organización estructural de los ácidos nucleicos. M., Mir, 1987
En 1944, los experimentos de Avery, McLeod y McCarthy demostraron que la capacidad de formar una cápsula en una cepa acapsular mutante de neumococo podía restaurarse introduciendo en sus células ADN neumocócico purificado capaz de producir una cápsula. Los autores llamaron al agente (ADN) responsable de este cambio un "factor de transformación". Muy pronto, el método de transformación se volvió ampliamente utilizado en la investigación genética. Hace relativamente poco tiempo, se llevaron a cabo experimentos en los que células de levadura, células de mamífero, embriones de roedores e insectos sirvieron como receptores, y el ADN clonado sirvió como donante de información genética.
Propiedades químicas del ADN
La naturaleza química de las unidades monoméricas que forman el ADN (desoxiadenilato, desoxicitidilato, desoxiguanilato y timidilato) se describe en el cap. 34. Los monómeros se polimerizan con la formación de enlaces 3,5-fosfodiéster, formando una sola hebra de ADN (Fig. 37.1). La información en el ADN está escrita en forma de una secuencia específica de desoxirribonucleótidos de purina y pirimidina.
La molécula de ADN polimérico, como puede verse en la figura, es polar. En un extremo está el 5-hidroxilo - (o grupo fosfato), en el otro 3-fosfato - (o grupo hidroxilo). Basado en los datos del análisis de difracción de rayos X del ADN y la regla de Chargaff, según la cual el contenido de residuos de desoxiadenosina (A) en una molécula de ADN es igual al contenido de timidina (T), y el contenido de desoxiguanosina (G ) es igual al contenido de desoxicitosina (C), Watson, Crick y Wilkins propusieron a principios de los años 50 el modelo de la estructura bicatenaria del ADN. El modelo de la forma B de ADN se muestra en la fig. 37.2. Las dos cadenas de esta molécula bicatenaria dextrógira se mantienen unidas por enlaces de hidrógeno formados entre las bases de purina y pirimidina. La formación de pares complementarios es estrictamente específica. A siempre se acopla con (Fig. 37. 3).
En una molécula de doble cadena, las restricciones debidas a la inhibición de la rotación alrededor del enlace fosfodiéster, la "autoconfiguración predominante de los enlaces glucosídicos" (fig. 34.9) y las formas tautoméricas predominantes de las cuatro bases (A, G, T y C , Fig. 34.3) crean condiciones en las que A puede formar un par fuerte solo con T y G solo con C (Fig. 37.3). Esto es lo que explica las reglas de Chargaff (A=T; G=C). Las dos hebras de la doble hélice, siendo polares, son y
Arroz. 37.1. Fragmento de la estructura de una molécula de ADN en el que las bases de purina y pirimidina adenina (A), timina (T), citosina (C) y guanina (G) se mantienen unidas por un esqueleto de fosfodiéster que conecta -residuos de desoxirribosilo unidos por un - enlace glucosídico con las bases nucleicas correspondientes. Tenga en cuenta: el esqueleto de fosfodiéster de una sola hebra de ADN tiene "polaridad" (es decir, se puede distinguir una cierta dirección en él, por ejemplo).
antiparalelo, es decir, la dirección de un circuito y el otro. Tal imagen se asemeja a dos calles paralelas con tráfico de un solo sentido dirigido en direcciones opuestas. Una de las dos cadenas de ADN complementarias, que contiene información sobre la estructura de un gen particular en forma de una secuencia de nucleótidos específica, generalmente se denomina codificación (o plantilla); la otra cadena complementaria a ésta se denomina no codificante.
Como se muestra en la fig. 37.3, se forman tres enlaces de hidrógeno entre los residuos de desoxiguanosina y desoxicitidina, y solo dos entre timidina y desoxiadenosina. Por lo tanto, el enlace G-C es más fuerte en aproximadamente un 50 %. Esta circunstancia, así como las interacciones de apilamiento, pueden explicar la mayor temperatura de desnaturalización (fusión) de las regiones de ADN ricas en GC.
estructura del ADN
El ADN puede formar varios tipos de dobles hélices. Actualmente, ya se conocen seis formas (de la A a la E y la forma Z). La mayoría de las variantes estructurales del ADN solo pueden existir en condiciones experimentales estrictamente controladas. Estas opciones difieren 1) en el número de pares de bases por vuelta de la doble hélice; 2) la distancia entre los planos de los pares de bases y el ángulo que forman con el eje de la hélice; 3) el diámetro de la espiral; 4) orientación (derecha, izquierda) de la doble hélice (Tabla 37.1).
Algunas de estas formas cambian entre sí con cambios en la concentración de sal y el grado de hidratación. Es posible que las transiciones entre diferentes formas estructurales de ADN también ocurran in vivo.
Arroz. 37.2. Modelo de Watson y Crick de la estructura de doble hélice en forma de B. Izquierda: Representación esquemática de una molécula (A - adenina, C - citosina, G - guanina, T - timina, P - fosfato, S-azúcar [desoxirribosa]). Derecha: modelo de estructura de ADN. (Fotografía de J.D. Watson, Molecular biology of the Gene 3rd ed. Copyrght 1976, 1970, 1965 by W. A. Benjamin, Inc., Menlo Park, Calif.)
En condiciones fisiológicas (baja concentración de sal, alto grado de hidratación), el tipo estructural dominante de ADN es la forma B. El paso de hélice de tal molécula es de 3,4 nm. Una bobina de ADN se puede representar como dos pilas retorcidas de "monedas", 10 en cada una. Las pilas se mantienen unidas por enlaces de hidrógeno entre dos "monedas" opuestas de las pilas, y están "envueltas" con dos cintas de una columna vertebral de fosfodiéster retorcidas en una hélice dextrógira. En condiciones de hidratación menos alta y con un mayor contenido de iones Na + o K +, surge una estructura ligeramente diferente: la llamada forma A. Esta conformación dextrógira tiene un diámetro de hélice mayor que la forma B y un mayor número de pares de bases por vuelta. Es similar a la estructura característica del ARN bicatenario o dúplex ARN-ADN. Las formas C-E también son diestras, su formación solo puede observarse en experimentos especiales y, aparentemente, no existen in vivo.
forma de Z. El ADN es una doble hélice levógira, en la que el esqueleto de fosfodiéster zigzaguea a lo largo del eje de la molécula. De ahí el nombre de la molécula (zigzag)-ADN. Z-DNA es el menos retorcido (12 pares de bases por vuelta) y el más delgado conocido en la naturaleza, tiene un solo surco (ver más abajo). El Z-DNA se detecta en secuencias repetidas de desoxinucleótidos de purina y pirimidina alternantes (GC o AC) en presencia de otros factores estabilizadores. Estos incluyen: 1) una alta concentración de sal o la presencia de cationes específicos como espermina y espermidina; 2) un alto contenido de superenrollamientos negativos en la molécula de ADN (cap. 38); 3) unión de proteínas específicas de Z-DNA; 4) metilación del átomo de carbono-5 de algunos residuos de desoxicitidina.
El ADN en forma Z puede estar involucrado en la regulación de la expresión de genes tanto cercanos como significativamente distantes del sitio Z. Es probable que algunas proteínas que se unen en los surcos mayor o menor del ADN en forma B no puedan unirse a la forma Z del ADN. Además, la reversión de una sección de ADN de la forma Z a la forma B de ADN, que ocurre, por ejemplo, como resultado de la pérdida de grupos metilo por β-metildesoxicitidina. puede afectar el estado de torsión de los segmentos de ADN ubicados a una distancia considerable del área de reversión.
Arroz. 37.3. Formación de dos enlaces de hidrógeno (línea discontinua) entre las bases de desoxiadenosina y timidina (arriba) y tres enlaces de hidrógeno entre las bases de desoxiguanosina y desoxicitidina (abajo). En el ADN, el residuo de carbohidrato es 2-desoxirribosa; en el ARN, D-ribosa
La torsión y el desenrollado del ADN, así como la metilación de la desoxicitidina, probablemente afectan la actividad del gen (ver más abajo).
La presencia de Z-DNA en los cromosomas de Drosophila (mosca de la fruta) se ha demostrado utilizando anticuerpos específicos para la forma Z del ADN. Hay regiones en el ADN humano que son potencialmente capaces de transformarse en la forma Z; están dispersos en el genoma.
Tabla 37.1. Caracterización de algunos tipos de estructuras de ADN
Hay motivos para creer que las condiciones necesarias para la estabilización de la forma Z también se pueden realizar en células humanas.
Desnaturalización (fusión) del ADN
La estructura de doble cadena del ADN se puede "fundir" en solución elevando la temperatura o reduciendo la concentración de sal. Durante la fusión, no solo diverge la cadena de ADN, sino que también se interrumpe el sistema de interacciones de apilamiento de bases nucleicas dentro de esta cadena. Los enlaces fosfodiéster no se rompen en este caso. La desnaturalización del ADN va acompañada de un aumento de la absorción óptica de bases púricas y pirimidínicas. Este fenómeno se denomina efecto hipercrómico de la desnaturalización del ADN. La desnaturalización también elimina la alta viscosidad inherente a las soluciones de ADN nativo, cuya estructura similar a la fibra se debe tanto a las interacciones de apilamiento de las bases nucleicas en cada hebra como a las interacciones complementarias entre dos hebras.
La separación de las cadenas de una molécula de ADN dada ocurre dentro de un cierto rango de temperatura. El punto medio de este intervalo se llama punto de fusión del ADN o . El valor depende de la composición de nucleótidos del ADN y la concentración de sal en la solución. Las moléculas de ADN enriquecidas en pares G-C (están unidas por tres puentes de hidrógeno) se "derriten" a una temperatura más alta que las moléculas ricas en A-T (los pares A-T están unidos por dos puentes de hidrógeno). Un aumento de diez veces en la concentración de cationes monovalentes aumenta en 16,6 ° C. La formamida, comúnmente utilizada en experimentos con ADN recombinante, desestabiliza los enlaces de hidrógeno entre bases, reduciendo así . Esto permite que las hebras del híbrido de ADN o ADN-ARN diverjan a una temperatura más baja, lo que reduce la probabilidad de que se produzcan roturas de hebras individuales a altas temperaturas.
surcos en la estructura del ADN
Al estudiar el modelo que se muestra en la Fig. 37.2, se puede prestar atención a la presencia en la estructura del ADN de surcos mayores y menores, retorcidos alrededor del eje de la molécula paralelamente a la columna vertebral de fosfodiéster. En estos surcos, las proteínas pueden interactuar específicamente con ciertos átomos de bases nucleicas y, por lo tanto, "reconocer" secuencias de nucleótidos específicas sin perturbar las interacciones complementarias en la estructura de la doble hélice. Como se mostrará en el Cap. 39 y 41, es a través de tales interacciones que las proteínas reguladoras pueden controlar la expresión génica.
ADN relajado y superenrollado
El ADN de algunos organismos, como bacterias, bacteriófagos y muchos virus de ADN animal, es una estructura circular cerrada. Por supuesto, tal estructura no viola la polaridad de las moléculas, pero los grupos libres e hidroxilo y fosforilo desaparecen en ella. Los anillos cerrados pueden existir en formas relajadas o superenrolladas. El superenrollamiento se manifiesta cuando un anillo cerrado se enrolla alrededor de su propio eje o cuando se retuerce una sección de ADN lineal, cuyos extremos están fijos. Este proceso que requiere energía conduce a la aparición de una tensión intramolecular de la estructura. Con un aumento en el número de superespiras, aumenta la tensión interna (de torsión) (compruebe esto en una banda elástica normal). Las superenrollamientos en el ADN formadas girando en sentido contrario a las agujas del reloj (en la dirección opuesta a girar la doble hélice dextrógira de la forma B del ADN) se denominan negativas. En cierto sentido, podemos suponer que la energía necesaria para lograr dicho estado estructural se almacena en superenrollamientos ordinarios (no negativos). La energía de transición de una molécula de ADN a otro tipo de estructura supramolecular puede reducirse debido a la formación de regiones de torsión negativa. Una de esas transiciones es la separación de cadenas en preparación para la replicación y la transcripción. Esta es la razón por la que el superenrollamiento del ADN es muy beneficioso en los sistemas biológicos. Las enzimas que catalizan cambios topológicos en la molécula de ADN se denominan topoisomerasas. La más estudiada de ellas es la girasa bacteriana, que inicia la formación de superenrollamientos negativos.
Función del ADN
La información genética codificada en una secuencia de nucleótidos tiene dos propósitos. En primer lugar, es necesario para la síntesis de moléculas de proteína y, en segundo lugar, asegura la transferencia de sí mismo en una serie de generaciones de células y generaciones de organismos. Ambas funciones se basan en el hecho de que la molécula de ADN sirve como plantilla; en el primer caso para la transcripción, recodificando información en la estructura de las moléculas de ARN y en el segundo para la replicación, copiando información en moléculas hijas de ADN.
La complementariedad de las cadenas de doble hélice de Watson y Crick sugiere un modo semiconservador de replicación del ADN. Esto significa que las cadenas divergen y cada una sirve como molde para la síntesis de una nueva secuencia complementaria (fig. 37.4). Las dos moléculas de ADN de doble cadena resultantes, cada una de las cuales consta de una cadena principal y una complementaria recién sintetizada, se distribuyen entre dos células hijas (fig. 37.5). Así, cada una de las células hijas recibe información idéntica a la que posee la célula madre. Cada una de las dos células hijas retiene una hebra del ADN parental original.
El mecanismo semiconservador de replicación en la bacteria Escherichia coli se demostró sin ambigüedades en el experimento clásico de Meselson y Stahl utilizando un isótopo pesado de nitrógeno en combinación con centrifugación de equilibrio.
Arroz. 37.4. Estructura de doble cadena del ADN. Cada una de las dos cadenas de la molécula de ADN original se utiliza como molde para la síntesis de nuevas cadenas complementarias. (De J. D. Watson. Molecular biology of the Gene 3rd ed. Copyright 1976, 1970, 1965 by W. A. Benjamin, Inc., Menlo Park,
Arroz. 37.5. Distribución esperada de cadenas de ADN en replicación semiconservadora y conservadora. En la figura, las cadenas principales son negras y las cadenas nuevas son claras. (Rediseñado y reproducido con permiso de Lehninger A. L. Biochemistry 2nd. ed., Worth, 1975.)
El ADN de E. coli y el ADN humano son químicamente idénticos, aunque, por supuesto, sus secuencias de nucleótidos son diferentes y, además, una célula humana contiene aproximadamente 1000 veces más ADN que una bacteriana. Resultó que el mecanismo químico de la replicación del ADN es el mismo en procariotas, como E. coli, y eucariotas, incluidos los humanos, a pesar de que las enzimas involucradas en estos procesos difieren en las células procariotas y eucariotas. Hay muchas razones para creer que los datos obtenidos en el estudio de la química de los ácidos nucleicos de los organismos procarióticos también son aplicables a los sistemas eucarióticos. De hecho, los resultados de experimentos con células de mamíferos similares a los de Meselson y Stahl resultaron ser comparables con los datos obtenidos anteriormente sobre E. coli.
Si las soluciones de ADN viral o bacteriano se calientan lentamente, sus moléculas se desnaturalizan a temperaturas bastante determinadas (fig. 27-16). La transición del dúplex de ADN nativo a la forma desnaturalizada sin torcer, torcida aleatoriamente, puede detectarse mediante un aumento en la absorción de luz ultravioleta o mediante una disminución en la viscosidad de la solución de ADN. Cada tipo de ADN tiene su propia temperatura de desnaturalización, llamada "punto de fusión". Cuanto mayor sea el contenido de pares G=C en el ADN, mayor será el punto de fusión de este ADN. Esto se explica por el hecho de que los pares GC son más estables y se requiere más energía para su disociación que para la destrucción de los pares A=T; esto se debe en parte al hecho de que los pares G=C están conectados por tres enlaces de hidrógeno y los pares A=T por solo dos.
Por lo tanto, la determinación cuidadosa del punto de fusión de una preparación de ADN en condiciones fijas de pH y fuerza iónica puede proporcionar información sobre la relación de los pares A=T y G=C en el ADN.
La segunda propiedad física del ADN, determinada por la proporción de pares G=C y A=T, es la densidad de flotabilidad. La preparación de ADN con un contenido más alto de G=C-nap tiene una densidad ligeramente más alta que el ADN con un contenido más alto de pares A=T. Las preparaciones de ADN se centrifugan a alta velocidad en una solución concentrada de cloruro de cesio (), cuya densidad se encuentra en el mismo rango que la densidad del ADN.
Arroz. 27-15. El principio de la prueba de hibridación. Se calientan dos preparaciones de ADN aislado de organismos de diferentes especies para que se desnaturalicen por completo y sus cadenas diverjan. Cuando estas preparaciones se mezclan y se enfrían lentamente, las hebras de ADN complementarias de cada especie se encontrarán y se unirán para formar dúplex normales. Si existe una homología significativa en la secuencia entre dos ADN, entonces es posible la formación de moléculas híbridas, que son dúplex parciales. Cuanto mayor sea el grado de homología, más probable es la formación de híbridos. El contenido de híbridos en una mezcla se puede medir de varias maneras, en particular por cromatografía o centrifugación en gradiente de densidad. Por lo general, para simplificar el procedimiento de medición, uno de los ADN se marca con un isótopo radiactivo.
Arroz. 27-16. Curva de desnaturalización (fusión) de dos preparaciones de ADN. La temperatura correspondiente al punto de transición medio se llama punto de fusión. Dado que el valor depende del pH y la concentración de sal, siempre es necesario especificar las condiciones para su medición.
Durante la centrifugación en un tubo de centrífuga, se forma un gradiente de densidad con la mayor densidad en el fondo del tubo. Si se coloca ADN en él, primero se moverá hacia el fondo del tubo de ensayo, pero luego se detendrá en cierta posición y permanecerá a flote. En esta posición, no puede subir ni asentarse, ya que la densidad de la solución aquí es igual a su densidad. Con este método, que se describe con más detalle en el Cap. 28, es posible separar moléculas de ADN que difieren entre sí en el contenido de pares G=C, ya que tienen diferentes densidades de flotación. Con base en la densidad de flotación de este ADN, podemos calcular la proporción de pares G=C y A=T en él.
hibridación de ADN
hibridación de ADN, hibridación de ácidos nucleicos- conexión in vitroácidos nucleicos monocatenarios complementarios en una molécula. Con complementariedad completa, la combinación es fácil y rápida, y en caso de no complementariedad parcial, la fusión de cadenas se ralentiza, lo que permite evaluar el grado de complementariedad. Es posible la hibridación ADN-ADN y ADN-ARN.
Protocolo de experimento
- El ADN de doble cadena se calienta en un tampón apropiado. Debido a cambios en las condiciones externas, los enlaces de hidrógeno entre bases nitrogenadas complementarias se vuelven termodinámicamente desfavorables y las cadenas divergen.
- La preparación de ADN desnaturalizado se mezcla con otro ADN desnaturalizado.
- Las preparaciones se enfrían lentamente, mientras que los ADN monocatenarios se hibridan entre sí (se forman puentes de hidrógeno entre bases complementarias) y se forma una molécula de ADN "híbrida".
Un análisis de la tasa de hibridación del ADN monocatenario permite evaluar las similitudes y diferencias en las secuencias de ADN entre especies o individuos de la misma especie.
Cálculo del punto de fusión del ADN
La estructura secundaria del ADN juega un papel importante en biología, diagnóstico genético y otros métodos de biología molecular y nanotecnología. Por lo tanto, la determinación precisa del punto de fusión de las moléculas de ADN o ARN juega el papel más importante en todos los métodos de biología molecular, como la selección de muestras u oligonucleótidos para microarreglos o la selección de cebadores de PCR. Hay varias fórmulas simples para calcular el punto de fusión de los oligonucleótidos cortos. Cálculo aproximado del punto de fusión (Tm) de un oligonucleótido corto (<20 нуклеотидов) проводят по прямому подсчету количества нуклеотидов (G+C - сумма всех гуанинов и цитозинов , L - длина олигонуклеотида):
La fórmula promedio para calcular T m para un oligonucleótido corto (y para fragmentos largos de ADN), teniendo en cuenta la concentración de iones K + y DMSO:
Sin embargo, estas ecuaciones no tienen en cuenta el inicio de la unión durante la hibridación de oligonucleótidos, no tienen en cuenta las características de la propia secuencia y el efecto final característico de los dúplex de oligonucleótidos. Por tanto, esta fórmula es más adecuada cuando la secuencia de ADN es media y la longitud de los dúplex es superior a 40 nucleótidos.
termodinámica del ADN
El método más común utilizado hoy en día para calcular la temperatura de fusión del ADN de cadena doble o sencilla se basa en un modelo termodinámico de dos pasos. Dos moléculas de ADN complementarias A y B están unidas entre sí o libres en solución ("estado de bobina aleatoria"). Generalmente se asume que ambas moléculas A y B son completamente complementarias, por lo que su hibridación es obvia, y se permiten uno o más errores de complementariedad en el dúplex, incluyendo pares G-G, G-T y G-A no complementarios (wobble pairs). En el caso de una sola molécula, se supone que la empaqueta en una estructura de bucle. El proceso de hibridación en dúplex se describe mediante la fórmula:
donde A y B son cadenas diferentes en solución ("estado de bobina aleatoria"), y AB es el dúplex formado. Esta reacción es reversible. La constante de equilibrio k, para esta reacción se define como: .
La constante de equilibrio depende de la concentración de la cadena, la temperatura, la concentración de sal, el pH y otros componentes de la reacción (p. ej., glicerol o DMSO). La constante K cambia en respuesta a un cambio en la concentración de una o ambas cadenas ( y / o ), luego todo el sistema responde a los cambios y luego las concentraciones individuales de [A], [B] y también cambian. Por ejemplo, si hay más cadena A en el sistema, la concentración aumentará. Supongamos que la constante de equilibrio es 1.81x10 6 y la concentración de cadenas = = 10 -5 M:
Sustituimos los componentes en las fórmulas para calcular k:
Después de reorganizar, obtenemos:
Por ejemplo, sustituyendo en esta fórmula = 7.91x10 -6 M entonces la concentración de cadenas será [A] = [B] = 2.09x10 -6 M. Es decir, solo el 79% de las cadenas estarán conectadas en dúplex.
¿Es posible determinar las constantes de equilibrio con un cambio de temperatura? Esto nos lleva a la comprensión de importantes parámetros termodinámicos como la energía libre (dG), la entalpía (dH) y la entropía (dS). Los cambios en la energía libre, la entalpía y la entropía ocurren durante la transición de la "temperatura de hibridación T" a un estado desordenado y aleatorio. Estas relaciones están definidas por la fórmula dG = dH – TdS, (para la concentración de cadenas [A] = [B] = = 1M), entonces la fórmula ideal para calcular la energía libre de Gibbs es:
donde T es la temperatura en kelvins, dH° (cal/mol) y dS° (cal/mol K).
Existe una relación útil que relaciona el cambio en la energía libre de Gibbs durante una reacción química con su constante de equilibrio:
donde R es la constante universal de los gases (1,987 cal/mol K).
Combinando ambas fórmulas obtenemos:
La temperatura de fusión (T m) se determina en el equilibrio, cuando la mitad de las cadenas están conectadas entre sí y la otra mitad está en estado libre, es decir, k=1:
El punto de fusión para un bucle simple se calcula como . Para el dúplex de ADN, es necesario tener en cuenta la concentración de cada hebra (en moles, M). Así, si [A] y [B] son las concentraciones de las moléculas A y B, entonces la concentración total de cadenas, C, es igual a su suma, [A] + [B].
Se supone que la concentración de ambas cadenas es la misma [A] = [B] = C/2. En este caso,
donde f = 4. Para un oligonucleótido autocomplementario = C y luego f = 1. Esta temperatura de fusión se determina solo cuando la mitad de las moléculas están unidas entre sí.
Para un oligonucleótido autocomplementario, k = 1/ por lo tanto:
Para un dúplex no complementario, cuando ≥ , k =1/( – /2), Tm se calcula de la siguiente manera:
donde es la concentración molar de la hebra predominante (normalmente un cebador de PCR) y [Bt] es la concentración molar de la hebra de baja concentración (ADN genómico).
Cálculo del punto de fusión
Los parámetros termodinámicos dG, dH y dS se calculan con base en el modelo vecino más cercano. La predicción precisa de la estructura secundaria del ADN durante la hibridación mediante algoritmos de programación dinámica requiere una base de datos de todos los parámetros termodinámicos posibles para cada par de bases complementarias, así como para todos los desajustes, extremos libres, horquillas y bucles. La fórmula termodinámica para calcular un oligonucleótido corto se basa en los parámetros termodinámicos - entropía dS y entalpía dH, para cada una de las 10 combinaciones de cuatro nucleótidos (Tabla 1). La Tabla 1 muestra los parámetros termodinámicos para los vecinos más cercanos (NN) para pares de nucleótidos a una concentración de NaCl 1M.
Para calcular Tm (°С), todos los valores de energía libre de Gibbs para cada par se suman en incrementos de un nucleótido:
dG general = dG inicial + dG simetría +∑dG + dG AT final
dG teórico = 1,96 + 0 - 2,17 - 1,44 - 1,44 - 1,00 - 1,45 - 1,30 +0,05
dG teórico = -5,35 kcal/mol
Los valores de entropía (dH = -43,5 kcal/mol) y entalpía (dS = -122,5) se calculan de manera similar:
Muchos dúplex de ADN tienen estructuras monocatenarias que compiten entre sí y esto cambia el equilibrio del sistema y, como resultado, una disminución en el valor de T m del valor predicho por la fórmula.
La fórmula general para calcular T m con corrección por sal en solución es:
donde L es la longitud del oligonucleótido, R es la constante de los gases (1,987 cal/K mol), c es la concentración del oligonucleótido en (generalmente 2x10 −7 M), es la concentración de iones de potasio en moles (generalmente 5x10 − 2M).
| Secuencia de pares (5"-3"/3"-5") |
° kcal/mol |
° cal/(mol·K) |
° 37 kcal/mol |
|---|---|---|---|
| AA/TT | -7.6 | -21.3 | -1.00 |
| AT/TA | -7.2 | -20.4 | -0.88 |
| AT/AT | -7.2 | -20.3 | -0.58 |
| CA/GT | -8.5 | -22.7 | -1.45 |
| GT/CA | -8.4 | -22.4 | -1.44 |
| CT/GA | -7.8 | -21.0 | -1.28 |
| AG/TC | -8.2 | -22.2 | -1.30 |
| CG/GC | -10.6 | -27.2 | -2.17 |
| GC/GC | -9.8 | -24.4 | -2.24 |
| GG/CC | -8.0 | -19.9 | -1.84 |
| iniciación | +0.2 | -5.7 | +1.96 |
| par de terminales A-T | +2.2 | +6.9 | +0.05 |
| corrección de simetría | 0.0 | -1.4 | +0.43 |
Error único dentro de dúplex
El modelo de vecino más cercano para pares de nucleótidos complementarios se puede extender a pares que incluyen nucleótidos no complementarios. Se ha demostrado que existe una tendencia decreciente en la estabilidad de los pares de bases no complementarias en orden descendente:
G-C > A> GRAMO > GRAMO T ≥ GRAMO UN > T T ≥ UN UN > T C ≥ UN C ≥ C C
La guanidina G es la base más "promiscua" porque forma fuertes pares de bases con bases no complementarias (G·G, G·T y G·A). Por otro lado, la citosina C es la base más discriminatoria porque forma los pares complementarios más estables y los pares inestables con bases no complementarias (T·C ≥ A·C ≥ C·C) , .
Enlaces
ver también
- PrimerDigital: herramientas online para PCR y análisis de oligonucleótidos
