Fizinės ir cheminės DNR savybės
| Parametrų pavadinimas | Reikšmė |
| Straipsnio tema: | Fizinės ir cheminės DNR savybės |
| Rubrika (teminė kategorija) | Sportas |
1. Denatūravimas
DNR denatūravimas atliekamas veikiant cheminiams veiksniams (karbamidui, guanidino chloridui, rūgštims, šarmui) ir fizikiniams veiksniams (temperatūrai). Dėl denatūracijos sunaikinama antrinė DNR struktūra. Pašalinus denatūruojančio faktoriaus poveikį, antrinė DNR struktūra turi būti atkurta. Šis procesas vadinamas renatūracija.
DNR denatūraciją arba tirpimą lydi DNR tirpalų optinio tankio padidėjimas esant 260 nm bangos ilgiui. Šis reiškinys vadinamas hiperchrominiu efektu. Didžiausias DNR tirpalo optinio tankio padidėjimas jo visiško skilimo iki mononukleotidų esant nurodytam bangos ilgiui yra maždaug 80%.
DNR molekulė, susidedanti tik iš poli-d(AT), lydosi žemesnėje temperatūroje nei DNR molekulė, susidedanti iš poli-d(GC). Taip yra dėl to, kad tarp A ir T susidaro du vandeniliniai ryšiai, o tarp G ir C – trys vandenilio ryšiai.
2. Lydymosi temperatūra
Svarbiausia DNR charakteristika yra jos lydymosi temperatūra, kuri atitinka temperatūrą, kurioje DNR tirpalo optinio tankio padidėjimas yra lygus pusei didžiausio jo padidėjimo, stebimo visiško DNR denatūravimo metu. DNR, susidedančios iš poli-d(AT), lydymosi temperatūra yra 66 o C, DNR, susidedančios iš poli-d(GC), 85 o C. Natūralios DNR lydymosi temperatūra yra didesnė nei 66 o C, bet mažesnė nei 85 o C. C, nes jose yra visos keturios azoto bazės, bet skirtinguose gyvuose organizmuose skirtingomis proporcijomis. Taigi žmogaus DNR būdinga lydymosi temperatūra, lygi 81 - 82 o C, E. coli - 90,5 o C.
Kai DNR tirpalas atšaldomas (atkaitinamas), pagal komplementarumo principą galima atkurti pirminę antrinę DNR struktūrą.
3. Hibridizacija
Jei skirtingų DNR molekulių mišinys iš pradžių išlydomas, o paskui atkaitinamas, tada, jei jų pirminės struktūros yra panašios, galima hibridizacija tarp DNR molekulių.
Paveikslas – Hibridizacija tarp skirtingų DNR molekulių
Kuo didesnis DNR molekulių panašumas, tuo didesnis hibridizacijos laipsnis. Remiantis skirtingų gyvų organizmų rūšių DNR hibridizacijos rezultatais, galima spręsti apie jų ryšį. Kuo didesnis hibridizacijos laipsnis, tuo glaudesnis ryšys tarp analizuojamų rūšių.
Hibridizacija taip pat galima tarp DNR ir RNR molekulių, jei yra homologinių nukleotidų sekos.
Paveikslas – DNR ir RNR hibridizacija
4. Nukleino rūgštys stipriai sugeria ultravioletinę šviesą, ir ši savybė yra jų koncentracijos nustatymo pagrindas. Su ta pačia savybe siejamas ir mutageninis ultravioletinių spindulių poveikis.
eukariotų DNR organizacija
Eukariotinės DNR molekulės ilgis daug kartų didesnis už ląstelės dydį. Siekiant užtikrinti įvairių biologinių procesų eigą, jis turi būti tinkamai supakuotas. Yra keli jo tankinimo lygiai.
1. Nuoga DNR – tai dviguba spiralė, jos skersmuo 1,8 nm˸
Tokia DNR yra itin jautri DNazėms – fermentams, kurie hidrolizuoja fosfodiesterio ryšius.
DNR fizinės ir cheminės savybės – samprata ir rūšys. Kategorijos „DNR fizikinės ir cheminės savybės“ klasifikacija ir ypatumai 2015, 2017-2018 m.
DNR struktūra
DNR formos
DNR nukleotidų sudėtis
DNR tirpimas
DNR topologija
DNR yra molekulė, susidedanti iš dviejų antilygiagrečių molekulių, sujungtų vandeniliniais ryšiais pagal komplementarumo principą susidarant spiralinei struktūrai.
DNR struktūra
Struktūrinis DNR grandinės vienetas yra dezoksiribonukleozidas, susidedantis iš fosfato, dezoksiribozės cukraus ir keturių nukleotidų: adenino (A), citozino (C), guanino (G) ir timino (T). Kai kuriuose faguose timiną pakeičia Uracil (PBS1 fagas), kuris paprastai yra įtrauktas į RNR. Dviejų DNR grandžių nukleotidai yra sujungti vandeniliniais ryšiais pagal komplementarumo principą: A-T, G-C.purinai (2 žiedai) -Adeninas, Guanino pirimidinai -Timinas, Citozinas |
dDNR = 20A; - purinui-12A, pirimidinui-8A |
A-T poroje yra 2 H-ryšiai, G-C poroje yra 3 |
Besisukanti DNR molekulė
Bazinė tautomerija
Heterocikluose protonai, susieti su azotu, gali praeiti
ant kitų azoto atomų arba ant keto grupės deguonies atomų, o tirpaluose bus įvairių tautomerinių struktūrų, greitai transformuojančių viena į kitą, pusiausvyra.
Dėl tautomerinių transformacijų U ir G enolio formos poravimosi metu gali imituoti C ir A, o imino formos C ir A gali imituoti U ir G, o tai gali sukelti DNR mutacijas (pav.).
Staking sąveika
DNR grandinėje esančios bazės guli viena ant kitos krūvoje, o tai suteikia papildomą grandinės stabilizavimą – krovimo sąveiką.
Sąveikos tarp bazių vertė: purinas-purinas>pirimidinas-purinas>pirimidinas-pirimidinas
Oligo- ir polinukleotiduose, susidėliojus tarp gretimų bazių, susidaro stabili vienos grandinės spiralinė struktūra (polyA), o nesant krūvos susidaro netvarkinga ritė (poliU).
Krovimo sąveikos energija ~ -3 - -15 kcal/mol
Cukraus ir fosfato stuburas, esantis už pagrindo, dezoksirobozės fosfatų viduje, yra sujungtas fosfodiesterio jungtimis. Fosfato OH grupės yra sujungtos
su OH grupe ant 3" ir 5" dezoksiribozės anglies atomų.
Neatitikimas gali atsirasti, kai timinas yra enolio formos arba citozinas yra imino formos.
Nukleotidų modifikacijos
pav.1 Modifikuoti nukleotidai[Dainininkas].
DNR nukleotidai gali keistis: 5-metilcitozinas,
5-hidroksimetilcitozinas, 5-hidroksimetiluracilas,
N-metiladeninas. Kai kurių bakteriofagų DNR mono- arba disacharidai yra prijungti prie hidroksimetilcitozino hidroksimetilo grupės glikozidiniu ryšiu. Daugumos žemesniųjų eukariotų ir bestuburių DNR yra palyginti nedaug 5-metilcitozino ir
N6-metiladeninas. Stuburiniuose gyvūnuose vyksta bazinis metilinimas
svarbus vaidmuo reguliuojant genų ekspresiją, o 5-metilcitozinas yra labiausiai paplitęs. Parodyta, kad
daugiau nei 95% metilo grupių stuburinių DNR yra retų CG dinukleotidų citozino liekanose, o daugiau nei 50% šių dinukleotidų yra metilinti. Augaluose 5-metilcitoziną galima rasti CG dinukleotiduose
ir CNG trinukleotidai (N – C, A arba T).
DNR formos
| Galimybės | B formos | A formos | C formos | Z formos |
| spiralė | dešiniarankiams | dešiniarankiams | dešiniarankiams | kairiarankis |
| vienetų kartoti | 1 pirmadienis | 1 mėn | 1 mėn | 2 mėn |
| mon apyvartoje | 10,4 | 10,7 | 9.3 | 12 |
| skersmuo | 23,7A | 25,5A | 18.4A | |
| rotacija/men | 35,9 | 33,6 | 38,7 | 60/2 |
| mon polinkis į ašį | -1,2 | +19 | -9 | |
| rast. m-y mon išilgai ašies | 0,332 nm | 0,23 nm | 0,38 nm | |
| posūkio ilgis | 34A | 28A | 31A | 34.4A |
Tiriant DNR įvairiais metodais, buvo rasta įvairių DNR formų, susidariusių įvairiomis sąlygomis (druskų koncentracija, drėgmė), kai kurios iš jų gali egzistuoti gyvuose organizmuose.
Yra DNR formų A, B, C, D, T šeimos, kurios gali būti suskirstytos į skirtingus potipius (C, C"").
B-DNR- pagrindinė DNR būklė, parodyta kristaluose ir vandeniniuose tirpaluose.
C-DNR- forma, kuri egzistuoja esant sumažintai Na koncentracijai ir 44-66 % drėgmei, jei GC=31-72 %.
A-DNR- ši forma susidaro DNR-RNR hibriduose, todėl transkripcijos metu DNR pereina į A formą, kontakto RNR-pol vietoje. Šiai formai būdinga 5A skersmens vidinė tuštuma.
Z-DNR- kairiarankė forma B-->Z perėjimą palengvina GC-5" seka, kuri yra organizmų metilinimo vieta. Tokios sekos plazmidėse superspiralės metu keičiasi iš B į Z formą.
B-->Z perėjime 11 bp sekcija turi pereinamąją formą tarp kairiosios ir dešiniosios spiralės.
Z-DNR rasta D. melanogaster politeninių chromosomų tarpjuostėse.
GC-5" polinukleotidas, būdamas B formos, sudaro nukleosomas esant mažoms druskų koncentracijoms. Esant didelei druskos koncentracijai, GC-5" polinukleotidas pereina į Z formą, kuri nesudaro nukleozomų.
A-, Z-formos negali egzistuoti vandeniniame tirpale be papildomo poveikio (baltymų, superspiralių).
D-DNR- AT turtingos T2 fago DNR sritys, kuriose citozinas yra pakeistas 5"-hidroksimetilcitozinu, vienintelė žinoma natūrali DNR yra D formos. Be to, fago DNR yra glikozilinta daugiau nei 70%.
Dviguba DNR spiralė yra labiau susisukusi nei B-DNR ir turi gilų mažą griovelį – patogią ertmę vandeniui ir katijonams.
3D DNR struktūros
DNR kreivumas
DNR nukleotidų sudėtis
Chargaf taisyklės
Kai kurių DNR nukleotidų sudėtis
organizmai[Dainininkas].
| Šaltinis | BET | G | C | T | A+T/G+C | A+G/T+C | G+C, mol. proc. |
| Bakteriofagas λ Bakteriofagas T2 Escherichia coli Bacillus subtilis Shoup papilomos virusas Saccharomyces cerevisiae Chlamidomonas viščiukas Pelė Karvė Kvieciai |
26,0 32,5 23,8 29,0 26,6 31,3 19,6 27,9 28,9 27,3 27,2 |
23,8 18,2 26,0 20,7 24,5 18,7 30,2 21,2 21,1 22,5 22,6 |
24,3 16,72 26,4 21,3 24,2 17,1 30,0 21,5 20,3 22,5 22,8 |
25,8 32,6 23,8 29,0 24,7 32,9 |
1,08 1,86 0,91 1,38 1,05 1,79 0,65** 1,34** 1,44** 1,22** 1,20** |
0,99 1,03* 0,99 0,99 1,04 1,00 0,99** 0,96** 1,00** 0,99** 0,99** |
48 35* 52 42 49 36 60** 43** 41** 44** 45** |
* 5-hidroksimetilcitozinas
** įskaitant 5-metilcitoziną
Eukariotuose 5"-CG-3" pasireiškimo dažnis yra didesnis nei 5"-GC-3, nes 5"-GC-3" dinukleotidas yra metilinamas, dalyvaujantis reguliuojant genų ekspresiją. Prokariotuose santykis 5'-CG-3'/5'-GC-3' yra artimas atsitiktiniam (žr. lentelę).
DNR molekulių dydis
DNR dydis išreiškiamas bazių poromis (bp) arba tūkstančiais bazių porų (bp)
| Šaltinis | M, taip | Ilgis | mon | Struktūros tipas |
| Bakteriofagas φX174 SV40 Bakteriofagas T2 Hemophilus influenzas chromosoma Escherichia coli chromosoma Saccharomyces cerevisiae 1 chromosoma 12 chromosoma Drosophila melanogaster 2 chromosoma 3 chromosoma 4 chromosoma |
1,6 10 6
3,5 10 6 1,2 10 8 7,9 10 8 2,6 10 8 1,4 10 8
4 10 10
|
1,6 µm 1,1 µm 50 µm 300 µm 1 mm 50 µm 15 mm |
5 10 3
5,2 10 3 2 10 5 1,2 10 6 4 10 6 2,1 10 5
6,0 10 7
|
Apvalus viengubas Apvalus dvigubas siūlas Linijinė dviguba sruoga nežinomas Apvalus dvigubas siūlas Linijinė dviguba sruoga Linijinė dviguba sruoga |
DNR tirpimas
Denatūravimas arba tirpstantis- DNR grandinių divergencija, kai DNR kaitinama iki ~1000C arba kai padidėja pH.
Grandinių nukrypimas atsiranda dėl silpno vandenilio sunaikinimo
ryšiai ir plokščiosios sąveikos tarp bazių.
Denatūracijai įtakos turi ir: vienvalenčių ir dvivalenčių metalų jonai, baltymai, neutralizuojantys neigiamus fosfatų grupių krūvius.
GC lydymosi temperatūra yra aukštesnė nei AT. Norint nutraukti dvi AT porų H jungtis, reikia mažiau energijos nei nutraukti tris GC porų H ryšius; temperatūra ir pH reikšmės, kuriose vyksta denatūracija, priklauso nuo DNR nukleotidų sudėties.
DNR lydymosi kreivė
Denatūracija yra grįžtamasis procesas, vėlesnis dvigrandės DNR struktūros atstatymas gali įvykti net ir visiškai nukrypus grandinėms. Susijungimo procesas, vadinamas renatūracija, reasociacija arba atkaitinimu, įvyksta tada, kai
temperatūros ar pH kritimas
Staigiai sumažėjus temperatūrai ar pH, dėl poravimosi sunku tinkamai sujungti vienas kitą papildančias grandines.
vietiškai vienas kitą papildančių regionų bazės toje pačioje arba skirtingose grandinėse.
DNR renatūracija vyksta esant ~200C žemesnei nei lydymosi temperatūrai.
Renatūracijos metu grandinės sekcijos su pasikartojančiomis DNR iš pradžių sujungiamos, o po to su unikaliomis atkarpomis.
DNR renatūracijos kreivė
t lydyti prieš konc. druskos
DNR savybės
Ultragarsas supjausto DNR į vienodus ~ 500 bp ilgio fragmentus.
DNR netirpi nepoliniuose tirpikliuose.
Šarmas hidrolizuoja DNR.
Dėl fosfatų grupių krūvio DNR turi neigiamą krūvį.
DNR molekulių topologija
Literatūra:
- Dainininkas: Genai ir genomai v.1
- Zenger.V: Nukleino rūgščių struktūrinės organizavimo principai. M., Mir, 1987 m
1944 m. Avery, McLeod ir McCarthy eksperimentai parodė, kad gebėjimas suformuoti kapsulę mutantinėje akapsulinėje pneumokoko padermėje gali būti atkurtas, į jos ląsteles įvedant išgrynintą pneumokokinę DNR, galinčią pagaminti kapsulę. Autoriai pavadino agentą (DNR), atsakingą už šį pokytį, „transformuojančiu veiksniu“. Labai greitai transformacijos metodas buvo plačiai naudojamas genetiniuose tyrimuose. Palyginti neseniai buvo atlikti eksperimentai, kuriuose mielių ląstelės, žinduolių ląstelės, graužikų ir vabzdžių embrionai buvo recipientai, o klonuota DNR – genetinės informacijos donorė.
Cheminės DNR savybės
Monomerinių vienetų, sudarančių DNR (deoksiadenilatas, deoksicitidilatas, deoksiguanilatas ir timidilatas), cheminė prigimtis aprašyta skyriuje. 34. Monomerai polimerizuojasi susidarant 3,5-fosfodiesterio ryšiams, sudarydami vieną DNR grandinę (37. 1 pav.). Informacija DNR yra įrašyta kaip specifinė purino ir pirimidino dezoksiribonukleotidų seka.
Polimerinė DNR molekulė, kaip matyti iš paveikslo, yra polinė. Viename gale yra 5-hidroksilo - (arba fosfato grupė), kitame - 3-fosfato - (arba hidroksilo grupė). Remiantis DNR rentgeno difrakcinės analizės duomenimis ir Chargaff taisykle, pagal kurią deoksiadenozino (A) likučių kiekis DNR molekulėje yra lygus timidino (T), o deoksiguanozino (G) kiekiui yra lygus deoksicitozino (C), Watson, Crick ir Wilkins kiekiui, pasiūlytam 50-ųjų DNR dvigrandės struktūros modelio pradžioje. DNR B formos modelis parodytas fig. 37.2. Dvi šios dešiniosios, dvigrandės molekulės grandinės yra laikomos kartu vandeniliniais ryšiais, susidariusiais tarp purino ir pirimidino bazių. Papildomų porų formavimas yra griežtai specifinis. A visada dera su (37. 3 pav.).
Dvigrandėje molekulėje apribojimai dėl sukimosi aplink fosfodiesterio jungtį slopinimo, vyraujančios „glikozidinių ryšių autokonfigūracijos (34.9 pav.) ir vyraujančių keturių bazių (A, G, T ir C) tautomerinių formų. , 34.3 pav.) sudaro sąlygas, kuriose A gali sudaryti stiprią porą tik su T, o G tik su C (37.3 pav.). Tai paaiškina Chargaff taisykles (A = T; G = C). Dvi dvigubos spiralės gijos, būdamos polinės, yra ir
Ryžiai. 37.1. DNR molekulės struktūros fragmentas, kuriame purino ir pirimidino bazės adeninas (A), timinas (T), citozinas (C) ir guaninas (G) yra laikomos kartu fosfodiesterio pagrindo, jungiančio dezoksiribozilo liekanas, sujungtas glikozidinis ryšys su atitinkamomis nukleino bazėmis. Atkreipkite dėmesį: vienos DNR grandinės fosfodiesterio stuburas turi „poliškumą“ (t.y., pavyzdžiui, jame galima išskirti tam tikrą kryptį).
antilygiagreti, t.y. vienos ir kitos grandinės kryptis. Šis paveikslas primena dvi lygiagrečias gatves, kurių eismas nukreipiamas priešingomis kryptimis. Viena iš dviejų komplementarių DNR grandžių, kurioje yra informacijos apie konkretaus geno struktūrą konkrečios nukleotidų sekos pavidalu, paprastai vadinama koduojančia (arba šablonu); kita ją papildanti grandinė vadinama nekoduojančia.
Kaip parodyta pav. 37.3, tarp deoksiguanozino ir deoksicitidino liekanų susidaro trys vandenilinės jungtys, o tarp timidino ir deoksiadenozino – tik dvi. Todėl G-C ryšys yra stipresnis maždaug 50%. Ši aplinkybė, taip pat krovimosi sąveika, gali paaiškinti aukštesnę GC turtingų DNR sričių denatūravimo (lydymosi) temperatūrą.
DNR struktūra
DNR gali sudaryti kelių tipų dvigubas spirales. Šiuo metu jau žinomos šešios formos (nuo A iki E ir Z formos). Dauguma struktūrinių DNR variantų gali egzistuoti tik griežtai kontroliuojamomis eksperimentinėmis sąlygomis. Šios parinktys skiriasi 1) bazinių porų skaičiumi vienam dvigubos spiralės apsisukimui; 2) atstumas tarp bazių porų plokštumų ir kampas, kurį jos sudaro su spiralės ašimi; 3) spiralės skersmuo; 4) dvigubos spiralės orientacija (dešinė, kairė) (37. 1 lentelė).
Kai kurios iš šių formų keičiasi viena į kitą, keičiantis druskos koncentracijai ir hidratacijos laipsniui. Gali būti, kad perėjimai tarp skirtingų struktūrinių DNR formų taip pat vyksta in vivo.
Ryžiai. 37.2. Watsono ir Cricko B formos dvigubos spiralės struktūros modelis. Kairėje: schematiškai pavaizduota molekulė (A – adeninas, C – citozinas, G – guaninas, T – timinas, P – fosfatas, S – cukrus [dezoksiribozė]). Dešinėje: DNR struktūros modelis. (Nuotrauka iš J. D. Watson, Molecular biology of the Gene 3rd ed. Copyrght 1976, 1970, 1965, W. A. Benjamin, Inc., Menlo Park, Kalifornija)
Fiziologinėmis sąlygomis (maža druskos koncentracija, didelis hidratacijos laipsnis) dominuojantis struktūrinis DNR tipas yra B forma. Tokios molekulės spiralės žingsnis yra 3,4 nm. DNR ritė gali būti pavaizduota kaip dvi susuktos „monetų“ krūvos, po 10 kiekvienoje. Krūvos yra laikomos vandeniliniais ryšiais tarp dviejų priešingų kaminų „monetų“ ir yra „apvyniotos“ dviem fosfodiesterio stuburo juostelėmis, susuktomis į dešiniąją spiralę. Mažesnės hidratacijos sąlygomis ir esant didesniam Na + arba K + jonų kiekiui, susidaro šiek tiek kitokia struktūra - vadinamoji A forma. Šios dešinės formos spiralės skersmuo yra didesnis nei B formos ir didesnis bazinių porų skaičius viename posūkyje. Ji panaši į struktūrą, būdingą dvigrandėms RNR arba RNR-DNR dupleksams. C-E formos taip pat yra dešiniarankės, jų formavimąsi galima stebėti tik specialių eksperimentų metu, o in vivo, matyt, neegzistuoja.
Z formos. DNR yra kairioji dviguba spiralė, kurioje fosfodiesterio stuburas yra zigzagu išilgai molekulės ašies. Iš čia ir kilo molekulės pavadinimas (zigzagas) – DNR. Z-DNR yra mažiausiai susisukusi (12 bazinių porų vienam apsisukimui) ir ploniausia gamtoje žinoma, turi tik vieną griovelį (žr. žemiau). Z-DNR aptinkama pasikartojančiose kintamų purino ir pirimidino deoksinukleotidų (GC arba AC) sekose, esant daugeliui kitų stabilizuojančių faktorių. Tai apima: 1) didelę druskos koncentraciją arba specifinių katijonų, tokių kaip sperminas ir spermidinas, buvimą; 2) didelis neigiamų superspiralių kiekis DNR molekulėje (žr. 38 sk.); 3) Z-DNR specifinių baltymų surišimas; 4) kai kurių deoksicitidino liekanų anglies-5 atomo metilinimas.
Z formos DNR gali būti susijusi su genų ekspresijos reguliavimu tiek arti, tiek gerokai nutolusių nuo Z vietos. Kai kurie baltymai, kurie jungiasi didžiuosiuose arba mažesniuose B formos DNR grioveliuose, greičiausiai negali prisijungti prie DNR Z formos. Be to, DNR dalies pakeitimas iš Z formos į B DNR formą, o tai įvyksta, pavyzdžiui, dėl metilo grupių praradimo β-metildeoksicitidinu. gali paveikti DNR segmentų, esančių dideliu atstumu nuo reversijos srities, sukimosi būseną.
Ryžiai. 37.3. Dviejų vandenilio jungčių (punktyrinė linija) susidarymas tarp deoksiadenozino ir timidino bazių (viršuje) ir trijų vandenilio jungčių tarp deoksiguanozino ir deoksicitidino bazių (apačioje). DNR angliavandenių liekana yra 2-deoksiribozė, RNR – D-ribozė
Sukimo sukimo-atvyniojimo DNR, taip pat deoksicitidino metilinimas tikriausiai veikia genų aktyvumą (žr. toliau).
Z-DNR buvimas Drosophila (vaisinės musės) chromosomose buvo įrodytas naudojant DNR Z formai būdingus antikūnus. Žmogaus DNR yra regionų, kurie potencialiai gali transformuotis į Z formą; jie yra pasklidę genome.
37.1 lentelė. Kai kurių tipų DNR struktūrų apibūdinimas
Yra pagrindo manyti, kad Z formos stabilizavimui reikalingos sąlygos gali būti įgyvendintos ir žmogaus ląstelėse.
DNR denatūravimas (lydymas).
Dvigrandė DNR struktūra gali būti „išlydyta“ tirpale, pakėlus temperatūrą arba sumažinant druskos koncentraciją. Lydymosi metu ne tik išsiskiria DNR grandinė, bet ir sutrinka nukleino bazių sąveikos šioje grandinėje sistema. Fosfodiesterio jungtys šiuo atveju nenutrūksta. DNR denatūraciją lydi purino ir pirimidino bazių optinės absorbcijos padidėjimas. Šis reiškinys vadinamas hiperchrominiu DNR denatūracijos efektu. Denatūracija taip pat pašalina didelį klampumą, būdingą natūralios DNR tirpalams, kurių skaidulą primenanti struktūra yra nulemta tiek nukleininių bazių sąveikos kiekvienoje grandinėje, tiek papildomos sąveikos tarp dviejų grandinių.
Tam tikros DNR molekulės grandinių atskyrimas vyksta tam tikrame temperatūros diapazone. Šio intervalo vidurio taškas vadinamas DNR lydymosi tašku arba . Vertė priklauso nuo DNR nukleotidų sudėties ir druskos koncentracijos tirpale. DNR molekulės, praturtintos G-C poromis (jos yra sujungtos trimis vandenilio tilteliais), „tirpsta“ aukštesnėje temperatūroje nei A-T turtingos molekulės (A-T poros yra sujungtos dviem vandenilio tilteliais). Dešimt kartų padidėjus vienvalenčių katijonų koncentracijai, padidėja 16,6 °C. Foramidas, dažniausiai naudojamas eksperimentams su rekombinantine DNR, destabilizuoja vandenilinius ryšius tarp bazių, taip sumažindamas . Tai leidžia DNR arba DNR-RNR hibrido sruogoms skirtis esant žemesnei temperatūrai, o tai sumažina tikimybę, kad atskiros grandinės nutrūks esant aukštai temperatūrai.
DNR struktūros grioveliai
Tiriant modelį, parodytą pav. 37.2, galima atkreipti dėmesį į tai, kad DNR struktūroje yra didelių ir mažų griovelių, susisukusių aplink molekulės ašį lygiagrečiai fosfodiesterio stuburui. Šiuose grioveliuose baltymai gali specifiškai sąveikauti su tam tikrais nukleino bazių atomais, todėl „atpažįsta“ specifines nukleotidų sekas, netrikdydami papildomos sąveikos dvigubos spiralės struktūroje. Kaip bus parodyta skyriuje. 39 ir 41, būtent per tokią sąveiką reguliuojantys baltymai gali kontroliuoti genų ekspresiją.
Atsipalaidavusi ir superspiruota DNR
Kai kurių organizmų, pavyzdžiui, bakterijų, bakteriofagų ir daugelio gyvūnų DNR virusų, DNR yra uždara žiedinė struktūra. Žinoma, tokia struktūra nepažeidžia molekulių poliškumo, tačiau laisvosios ir -hidroksilo bei fosforilo grupės joje išnyksta. Uždarieji žiedai gali egzistuoti atsipalaidavusių arba superspiralinių formų. Superspiralė pasireiškia tada, kai uždaras žiedas vyniojasi aplink savo ašį arba susisuka linijinės DNR atkarpa, kurios galai fiksuoti. Šis energijos reikalaujantis procesas lemia intramolekulinės struktūros padermės atsiradimą. Didėjant superritių skaičiui, didėja vidinis (sukimo) įtempis (patikrinkite tai ant paprastos guminės juostos). DNR superspiralės, susidarančios sukant prieš laikrodžio rodyklę (priešinga DNR B formos dešiniosios dvigubos spiralės sukimo kryptimi), vadinamos neigiamomis. Tam tikra prasme galime daryti prielaidą, kad tokiai struktūrinei būsenai pasiekti reikalinga energija yra saugoma įprastose (neneigiamose) superritėse. DNR molekulės perėjimo į kito tipo supramolekulinę struktūrą energija gali sumažėti dėl neigiamų sukimo sričių susidarymo. Vienas iš tokių perėjimų yra grandinės atskyrimas ruošiantis replikacijai ir transkripcijai. Štai kodėl DNR superspiralė yra labai naudinga biologinėse sistemose. Fermentai, katalizuojantys topologinius DNR molekulės pokyčius, vadinami topoizomerazėmis. Labiausiai ištirta iš jų yra bakterinė girazė, kuri inicijuoja neigiamų superspiralių susidarymą.
DNR funkcija
Nukleotidų sekoje užkoduota genetinė informacija turi du tikslus. Pirma, jis reikalingas baltymų molekulių sintezei, antra, užtikrina savęs perdavimą ląstelių kartų ir organizmų kartų serijoje. Abi funkcijos priklauso nuo to, kad DNR molekulė tarnauja kaip šablonas; pirmuoju atveju transkripcijai – informacijos perkodavimui į RNR molekulių struktūrą, o antruoju – replikacijai – informacijos kopijavimui dukterinėse DNR molekulėse.
Watson ir Crick dvigubos spiralės grandžių komplementarumas rodo pusiau konservatyvų DNR replikacijos būdą. Tai reiškia, kad grandinės išsiskiria ir kiekviena tarnauja kaip šablonas naujos papildomos sekos sintezei (37.4 pav.). Dvi gautos dvigrands DNR molekuls, kurias kiekviena sudaro viena pradin ir viena naujai susintetinta komplementari grandis, pasiskirsto dviejose dukterinse lsteles (37.5 pav.). Taigi kiekviena dukterinė ląstelė gauna informaciją, identišką tai, kurią turi pirminė ląstelė. Kiekviena iš dviejų dukterinių ląstelių išlaiko vieną pradinės tėvų DNR grandinę.
Pusiau konservatyvus replikacijos mechanizmas Escherichia coli bakterijoje buvo vienareikšmiškai įrodytas klasikiniame Meselsono ir Stahlo eksperimente, naudojant sunkųjį azoto izotopą kartu su pusiausvyros centrifugavimu.
Ryžiai. 37.4. Dvigrandė DNR struktūra. Kiekviena iš dviejų pirminės DNR molekulės grandinių naudojama kaip šablonas naujų komplementarių grandinių sintezei. (Iš J. D. Watson. Molecular biology of the Gene 3rd ed. Autorių teisės 1976, 1970, 1965, W. A. Benjamin, Inc., Menlo Park,
Ryžiai. 37.5. Numatomas DNR grandžių pasiskirstymas pusiau konservatyvioje ir konservatyvioje replikacijoje. Paveiksle pagrindinės grandinės yra juodos, o naujos - šviesios. (Perbraižyta ir atgaminta, leidus Lehninger A. L. Biochemistry 2nd. ed., Worth, 1975).
E. coli DNR ir žmogaus DNR yra chemiškai identiškos, nors, žinoma, skiriasi jų nukleotidų sekos, be to, žmogaus ląstelėje yra apie 1000 kartų daugiau DNR nei bakterinėje. Paaiškėjo, kad prokariotų, tokių kaip E. coli, ir eukariotų, įskaitant žmones, DNR replikacijos cheminis mechanizmas yra vienodas, nepaisant to, kad šiuose procesuose dalyvaujantys fermentai skiriasi prokariotinėse ir eukariotinėse ląstelėse. Yra pagrindo manyti, kad duomenys, gauti tiriant prokariotinių organizmų nukleorūgščių chemiją, tinka ir eukariotų sistemoms. Iš tiesų, eksperimentų su žinduolių ląstelėmis, panašių į Meselsono ir Stahlo ląsteles, rezultatai buvo palyginami su anksčiau gautais duomenimis apie E. coli.
Jei virusinės ar bakterinės DNR tirpalai lėtai kaitinami, tai jų molekulės denatūruojasi gana tam tikroje temperatūroje (27-16 pav.). Perėjimą nuo natūralios DNR dvipusės prie nesusuktos, atsitiktinai susuktos, denatūruotos formos galima aptikti padidinus ultravioletinių spindulių sugertį arba sumažinus DNR tirpalo klampumą. Kiekvienas DNR tipas turi savo denatūravimo temperatūrą, vadinamą „lydymosi temperatūra“. Kuo didesnis G=C porų kiekis DNR, tuo aukštesnė šios DNR lydymosi temperatūra. Tai paaiškinama tuo, kad GC poros yra stabilesnės ir jų disociacijai reikia daugiau energijos nei A=T porų sunaikinimui; iš dalies taip yra dėl to, kad G=C poros yra sujungtos trimis vandeniliniais ryšiais, o A=T poros – tik dviem.
Todėl kruopštus DNR preparato lydymosi temperatūros nustatymas fiksuotomis pH ir jonų stiprumo sąlygomis gali suteikti informacijos apie A=T ir G=C porų santykį DNR.
Antroji fizinė DNR savybė, nulemta G=C ir A=T porų santykio, yra plūduriuojantis tankis. DNR preparatas, turintis didesnį G=C-nap kiekį, turi šiek tiek didesnį tankį nei DNR, turintis didesnį A=T porų kiekį. DNR preparatai centrifuguojami dideliu greičiu koncentruotame cezio chlorido tirpale (), kurio tankis yra tame pačiame diapazone kaip ir DNR tankis.
Ryžiai. 27-15. Hibridizacijos testo principas. Du DNR preparatai, išskirti iš skirtingų rūšių organizmų, kaitinami taip, kad jie visiškai denatūruotųsi, o jų grandinės išsiskirtų. Kai šie preparatai sumaišomi ir lėtai aušinami, kiekvienos rūšies komplementarios DNR grandinės susiras viena kitą ir susijungs, sudarydamos normalius dupleksus. Jei tarp dviejų DNR yra didelė homologija, gali susidaryti hibridinės molekulės, kurios yra daliniai dupleksai. Kuo didesnis homologijos laipsnis, tuo didesnė hibridų susidarymo tikimybė. Hibridų kiekis mišinyje gali būti matuojamas įvairiais būdais, visų pirma taikant chromatografiją arba centrifuguojant pagal tankio gradientą. Paprastai, siekiant supaprastinti matavimo procedūrą, viena iš DNR yra paženklinta radioaktyviu izotopu.
Ryžiai. 27-16. Dviejų DNR preparatų denatūravimo (lydymosi) kreivė. Temperatūra, atitinkanti vidurinį perėjimo tašką, vadinama lydymosi temperatūra. Kadangi reikšmė priklauso nuo pH ir druskos koncentracijos, visada būtina nurodyti jos matavimo sąlygas.
Centrifuguojant centrifugos mėgintuvėlyje, vamzdelio apačioje susidaro tankio gradientas, kurio tankis didžiausias. Jei į jį įdėta DNR, ji pirmiausia pajudės mėgintuvėlio dugno link, bet tada sustos tam tikroje padėtyje ir liks ant vandens. Šioje padėtyje jis negali nei pakilti, nei nusistovėti, nes tirpalo tankis čia lygus jo tankiui. Šiuo metodu, kuris išsamiau aprašytas skyriuje. 28, galima atskirti viena nuo kitos DNR molekules, kurios skiriasi G = C porų turiniu, nes jos turi skirtingą plūduriavimo tankį. Remiantis šios DNR plūduriuojančiu tankiu, galime apskaičiuoti joje esančių G=C ir A=T porų santykį.
DNR hibridizacija
DNR hibridizacija, nukleorūgščių hibridizacija- ryšys in vitro komplementarias vienagrandes nukleorūgštis į vieną molekulę. Esant visiškam papildomumui, sąjunga yra lengva ir greita, o dalinio nekomplementarumo atveju grandinių susijungimas sulėtėja, todėl galima įvertinti papildomumo laipsnį. Galima DNR-DNR ir DNR-RNR hibridizacija.
Eksperimento protokolas
- Dvigrandė DNR pašildoma atitinkamame buferyje. Dėl išorinių sąlygų pokyčių vandeniliniai ryšiai tarp komplementarių azoto bazių tampa termodinamiškai nepalankūs ir grandinės išsiskiria.
- Denatūruotas DNR preparatas sumaišomas su kita denatūruota DNR.
- Preparatai lėtai atšaldomi, o viengrandės DNR susijungia viena su kita (tarp komplementarių bazių susidaro vandenilio ryšiai), susidaro „hibridinė“ DNR molekulė.
Vienagrandžių DNR atkaitinimo greičio analizė leidžia įvertinti DNR sekų panašumus ir skirtumus tarp rūšių ar tos pačios rūšies individų.
DNR lydymosi taško apskaičiavimas
Antrinė DNR struktūra vaidina svarbų vaidmenį biologijoje, genetinėje diagnostikoje ir kituose molekulinės biologijos bei nanotechnologijų metoduose. Todėl tikslus DNR arba RNR molekulių lydymosi temperatūros nustatymas atlieka svarbiausią vaidmenį visuose molekuliniuose biologiniuose metoduose, tokiuose kaip mėginių ar oligonukleotidų atranka mikrogardeliams arba PGR pradmenų atranka. Yra keletas paprastų formulių trumpųjų oligonukleotidų lydymosi temperatūrai apskaičiuoti. Apytikslis trumpo oligonukleotido lydymosi temperatūros (Tm) apskaičiavimas (<20 нуклеотидов) проводят по прямому подсчету количества нуклеотидов (G+C - сумма всех гуанинов и цитозинов , L - длина олигонуклеотида):
Vidutinė trumpojo oligonukleotido (ir ilgų DNR fragmentų) T m apskaičiavimo formulė, atsižvelgiant į K + jonų ir DMSO koncentraciją:
Tačiau šiose lygtyse neatsižvelgiama į jungimosi iniciaciją oligonukleotidų hibridizacijos metu, neatsižvelgiama į pačios sekos ypatybes ir galutinį efektą, būdingą oligonukleotidų dupleksams. Todėl ši formulė labiau tinka ten, kur DNR seka yra vidutinė, o dupleksų ilgis viršija 40 nukleotidų.
DNR termodinamika
Šiandien dažniausiai naudojamas dvigrandės arba viengrandės DNR lydymosi temperatūros apskaičiavimo metodas yra pagrįstas dviejų pakopų termodinaminiu modeliu. Dvi viena kitą papildančios DNR molekulės A ir B yra sujungtos viena su kita arba laisvos tirpale („atsitiktinės ritės būsena“). Paprastai daroma prielaida, kad abi molekulės A ir B yra visiškai viena kitą papildančios, todėl jų hibridizacija yra akivaizdi, o duplekse leistina viena ar daugiau komplementarumo paklaidų, įskaitant ir nekomplementarias G-G, G-T ir G-A poras (wobble poras). Jei yra tik viena molekulė, ji turėtų būti supakuota į kilpos struktūrą. Hibridizacijos į dupleksą procesas apibūdinamas formule:
kur A ir B yra skirtingos grandinės tirpale („atsitiktinės ritės būsena“), o AB yra susidaręs dupleksas. Ši reakcija yra grįžtama. Šios reakcijos pusiausvyros konstanta k apibrėžiama taip: .
Pusiausvyros konstanta priklauso nuo grandinės koncentracijos, temperatūros, druskos koncentracijos, pH ir kitų reakcijos komponentų (pvz., glicerolio arba DMSO). Pastovi K kinta reaguodama į vienos arba abiejų grandinių ( ir (arba) ) koncentracijos pasikeitimą, tada į pokyčius reaguoja visa sistema, o vėliau – atskiros [A], [B] koncentracijos ir taip pat keičiasi. Pavyzdžiui, jei sistemoje yra daugiau grandinės A, tada koncentracija padidės. Tarkime, kad pusiausvyros konstanta yra 1,81x10 6, o grandinių koncentracija = = 10 -5 M:
K apskaičiavimo formulėse pakeičiame komponentus:
Pertvarkę gauname:
Pavyzdžiui, pakeitus šioje formulėje = 7,91x10 -6 M, tada grandinių koncentracija bus [A] = [B] = 2,09x10 -6 M. Tai yra, tik 79% grandinių bus sujungtos dvipusiu būdu.
Ar galima nustatyti pusiausvyros konstantas keičiantis temperatūrai? Tai leidžia mums suprasti svarbius termodinaminius parametrus, tokius kaip laisvoji energija (dG), entalpija (dH) ir entropija (dS). Laisvosios energijos, entalpijos ir entropijos pokyčiai vyksta pereinant iš „hibridizacijos temperatūros T“ į netvarkingą, atsitiktinę būseną. Šie santykiai apibrėžiami formule dG = dH – TdS , (grandinių koncentracijai [A] = [B] = = 1M), tada ideali formulė Gibso laisvajai energijai apskaičiuoti yra:
kur T yra temperatūra kelvinais, dH° (cal/mol) ir dS° (cal/mol K).
Yra naudingas ryšys, susijęs su Gibso laisvosios energijos pokyčiu cheminės reakcijos metu su jos pusiausvyros konstanta:
kur R yra universali dujų konstanta (1,987 cal/mol K).
Sujungę abi formules gauname:
Lydymosi temperatūra (T m) nustatoma esant pusiausvyrai, kai pusė grandinių yra sujungtos viena su kita, o kita pusė yra laisvos būsenos, ty k=1:
Paprastos kilpos lydymosi temperatūra apskaičiuojama kaip . DNR dupleksui būtina atsižvelgti į kiekvienos grandinės koncentraciją (moliais, M). Taigi, jei [A] ir [B] yra molekulių A ir B koncentracijos, tai bendra grandinių koncentracija C yra lygi jų sumai [A] + [B].
Daroma prielaida, kad abiejų grandinių koncentracija yra vienoda [A] = [B] = C/2. Tokiu atveju,
kur f = 4. Savarankiškai komplementariam oligonukleotidui = C ir tada f = 1. Ši lydymosi temperatūra nustatoma tik tada, kai pusė molekulių yra surištos viena su kita.
Savarankiškai papildančiam oligonukleotidui k = 1/, todėl:
Nekomplementariam dupleksui, kai ≥ , k =1/( – /2), Tm apskaičiuojamas taip:
kur yra vyraujančios grandinės (dažniausiai PGR pradmens) molinė koncentracija, o [Bt] yra mažos koncentracijos grandinės (genominės DNR) molinė koncentracija.
Lydymosi taško skaičiavimas
Termodinamikos parametrai dG, dH ir dS apskaičiuojami pagal artimiausio kaimyno modelį. Norint tiksliai nuspėti antrinę DNR struktūrą hibridizacijos metu naudojant dinaminio programavimo algoritmus, reikalinga visų galimų kiekvienos papildomos bazinės poros termodinaminių parametrų duomenų bazė, taip pat visų neatitikimų, laisvų galų, plaukų segtukų ir kilpų duomenų bazė. Termodinaminė formulė trumpam oligonukleotidui apskaičiuoti pagrįsta termodinaminiais parametrais – entropija dS ir entalpija dH kiekvienam iš 10 keturių nukleotidų derinių (1 lentelė). 1 lentelėje parodyti artimiausių kaimynų (NN) termodinaminiai parametrai nukleotidų poroms, kai koncentracija yra 1 M NaCl.
Norint apskaičiuoti Tm (°С), visos Gibso laisvosios energijos vertės kiekvienai porai sumuojamos vieno nukleotido žingsniais:
dG bendras = dG pradinis + dG simetrija + ∑dG + dG AT galas
dG teorinis = 1,96 + 0 - 2,17 - 1,44 - 1,44 - 1,00 - 1,45 - 1,30 +0,05
dG teorinė = -5,35 kcal/mol
Entropijos (dH = -43,5 kcal/mol) ir entalpijos (dS = -122,5) reikšmės apskaičiuojamos panašiai:
Daugelis DNR dupleksų turi konkuruojančias vienos grandinės struktūras, ir tai perkelia sistemos pusiausvyrą ir dėl to sumažėja T m vertė nuo formulės numatytos vertės.
Bendroji T m apskaičiavimo formulė su druskos tirpale korekcija yra tokia:
kur L – oligonukleotido ilgis, R – dujų konstanta (1,987 cal/K mol), c – oligonukleotido koncentracija (paprastai 2x10 –7 M), kalio jonų koncentracija moliais (dažniausiai 5x10 – 2 M).
| Porų seka (5"-3"/3"-5") |
° kcal/mol |
° cal/(mol K) |
° 37 kcal/mol |
|---|---|---|---|
| AA/TT | -7.6 | -21.3 | -1.00 |
| AT/TA | -7.2 | -20.4 | -0.88 |
| TA/AT | -7.2 | -20.3 | -0.58 |
| CA/GT | -8.5 | -22.7 | -1.45 |
| GT/CA | -8.4 | -22.4 | -1.44 |
| CT/GA | -7.8 | -21.0 | -1.28 |
| GA/CT | -8.2 | -22.2 | -1.30 |
| CG/GC | -10.6 | -27.2 | -2.17 |
| GC/CG | -9.8 | -24.4 | -2.24 |
| GG/CC | -8.0 | -19.9 | -1.84 |
| inicijavimas | +0.2 | -5.7 | +1.96 |
| terminalo A-T pora | +2.2 | +6.9 | +0.05 |
| simetrijos korekcija | 0.0 | -1.4 | +0.43 |
Viena klaida dvipusio ryšio viduje
Artimiausias komplementarių nukleotidų porų kaimynų modelis gali būti išplėstas iki porų, kuriose yra nekomplementarių nukleotidų. Buvo įrodyta, kad nekomplementarių bazinių porų stabilumo mažėjimo tvarka mažėja:
G-C > A-T> G G > G T ≥ G A > T T ≥ A A > T C ≥ A C ≥ C C
Guanidinas G yra pati „išlaidingiausia“ bazė, nes sudaro stiprias bazių poras su nekomplementuojančiomis bazėmis (G·G, G·T ir G·A). Kita vertus, citozinas C yra labiausiai diskriminuojanti bazė, nes jis sudaro stabiliausias komplementarias poras ir nestabilias poras su nekomplementariomis bazėmis (T · C ≥ A · C ≥ C · C) , .
Nuorodos
taip pat žr
- „PrimerDigital“: internetiniai PGR ir oligonukleotidų analizės įrankiai
