տուն Ծառեր և թփեր ԴՆԹ-ի հալեցում. ԴՆԹ-ի ֆիզիկական և քիմիական հատկությունները Հանգիստ և գերոլորված ԴՆԹ

Ծառեր և թփեր

ԴՆԹ-ի հալեցում. ԴՆԹ-ի ֆիզիկական և քիմիական հատկությունները Հանգիստ և գերոլորված ԴՆԹ

ԴՆԹ-ի ֆիզիկական և քիմիական հատկությունները

Պարամետրի անվանումը	Իմաստը
Հոդվածի թեման.	ԴՆԹ-ի ֆիզիկական և քիմիական հատկությունները
Ռուբրիկա (թեմատիկ կատեգորիա)	Սպորտ

1. Դենատուրացիա

ԴՆԹ-ի դենատուրացիան իրականացվում է քիմիական գործոնների (միզանյութ, գուանիդին քլորիդ, թթու, ալկալի) և ֆիզիկական գործոնների (ջերմաստիճան) ազդեցության ներքո։ Դենատուրացիայի արդյունքում քայքայվում է ԴՆԹ-ի երկրորդական կառուցվածքը։ Երբ denaturing գործոնի ազդեցությունը վերացվում է, ԴՆԹ-ի երկրորդական կառուցվածքը պետք է վերականգնվի: Այս գործընթացը կոչվում է վերածնում:

ԴՆԹ-ի դենատուրացիան կամ հալումը ուղեկցվում է ԴՆԹ լուծույթների օպտիկական խտության բարձրացմամբ 260 նմ ալիքի երկարությամբ։ Այս երեւույթը կոչվում է հիպերքրոմային էֆեկտ։ ԴՆԹ-ի լուծույթի օպտիկական խտության առավելագույն աճը մոնոնուկլեոտիդների ամբողջական քայքայման ընթացքում նշված ալիքի երկարությամբ մոտավորապես 80% է:

ԴՆԹ-ի մոլեկուլը, որը բաղկացած է միայն poly-d(AT)-ից, հալվում է ավելի ցածր ջերմաստիճանում, քան poly-d(GC) կազմված ԴՆԹ-ի մոլեկուլը: Դա պայմանավորված է նրանով, որ A-ի և T-ի միջև առաջանում է երկու ջրածնային կապ, իսկ G-ի և C-ի միջև՝ երեք ջրածնային կապ:

2. Հալման կետ

ԴՆԹ-ի ամենակարևոր բնութագիրը նրա հալման ջերմաստիճանն է, որը համապատասխանում է այն ջերմաստիճանին, որի դեպքում ԴՆԹ լուծույթի օպտիկական խտության աճը հավասար է ԴՆԹ-ի ամբողջական դենատուրացիայի ժամանակ դիտված առավելագույն աճի կեսին: Poly-d(AT)-ից բաղկացած ԴՆԹ-ի հալման ջերմաստիճանը 66 o C է, պոլի-d(GC)-ից բաղկացած ԴՆԹ-ն 85 o C է: Բնական ԴՆԹ-ն ունի 66 o C-ից ավելի հալման ջերմաստիճան, բայց 85 o-ից պակաս: C, քանի որ դրանք ներառում են բոլոր չորս ազոտային հիմքերը, բայց տարբեր համամասնություններով տարբեր կենդանի օրգանիզմներում: Այսպիսով, մարդու ԴՆԹ-ն բնութագրվում է հալման կետով, որը հավասար է 81 - 82 o C, E. coli - 90,5 o C:

Երբ ԴՆԹ-ի լուծույթը սառչում է (կռում), ԴՆԹ-ի սկզբնական երկրորդական կառուցվածքը կարող է վերականգնվել փոխլրացման սկզբունքի համաձայն։

3. Հիբրիդացում

Եթե ԴՆԹ-ի տարբեր մոլեկուլների խառնուրդը սկզբում հալվում է, այնուհետև հալվում, ապա եթե դրանց առաջնային կառուցվածքներում նմանություն կա, հնարավոր է հիբրիդացում ԴՆԹ-ի մոլեկուլների միջև:

Նկար - Հիբրիդացում ԴՆԹ-ի տարբեր մոլեկուլների միջև

Որքան մեծ է ԴՆԹ-ի մոլեկուլների նմանությունը, այնքան բարձր է հիբրիդացման աստիճանը: Կենդանի օրգանիզմների տարբեր տեսակների ԴՆԹ-ի հիբրիդացման արդյունքների հիման վրա կարելի է դատել նրանց փոխհարաբերությունների մասին։ Որքան բարձր է հիբրիդացման աստիճանը, այնքան սերտ է փոխհարաբերությունները վերլուծված տեսակների միջև:

Հիբրիդացումը հնարավոր է նաև ԴՆԹ-ի և ՌՆԹ-ի մոլեկուլների միջև՝ պայմանով, որ կան հոմոլոգ նուկլեոտիդային հաջորդականություններ։

Նկար - ԴՆԹ-ի և ՌՆԹ-ի միջև հիբրիդացում

4. Նուկլեինաթթուները ուժեղ կլանում են ուլտրամանուշակագույն լույսը, և այս հատկությունն ընկած է դրանց կոնցենտրացիայի որոշման հիմքում։ Նույն հատկության հետ է կապված նաև ուլտրամանուշակագույն լույսի մուտագեն ազդեցությունը։

էուկարիոտական ԴՆԹ կազմակերպություն

Էուկարիոտական ԴՆԹ-ի մոլեկուլի երկարությունը շատ անգամ ավելի մեծ է, քան բջջի չափը։ Տարբեր կենսաբանական գործընթացների հոսքն ապահովելու համար այն պետք է համապատասխան փաթեթավորվի: Նրա խտացման մի քանի մակարդակ կա.

1. Մերկ ԴՆԹ - կրկնակի պարույր է, տրամագիծը 1,8 նմ˸ է

Նման ԴՆԹ-ն գերզգայուն է ԴՆազների՝ ֆոսֆոդիստերային կապերը հիդրոլիզացնող ֆերմենտների նկատմամբ։

ԴՆԹ-ի ֆիզիկական և քիմիական հատկությունները - հայեցակարգ և տեսակներ: «ԴՆԹ-ի ֆիզիկական և քիմիական հատկություններ» կատեգորիայի դասակարգումը և առանձնահատկությունները 2015, 2017-2018 թթ.

ԴՆԹ-ի կառուցվածքը
ԴՆԹ-ի ձևերը
ԴՆԹ-ի նուկլեոտիդային կազմը
ԴՆԹ-ի հալեցում
ԴՆԹ-ի տոպոլոգիա
ԴՆԹ-ն մոլեկուլ է, որը բաղկացած է երկու հակազուգահեռ մոլեկուլներից, որոնք կապված են ջրածնային կապերով՝ պարուրաձև կառուցվածքի ձևավորման հետ փոխլրացման սկզբունքով։

ԴՆԹ-ի կառուցվածքը

ԴՆԹ-ի շղթայի կառուցվածքային միավորը դեզօքսիռիբոնուկլեոզիդն է, որը բաղկացած է ֆոսֆատից, դեզօքսիռիբոզային շաքարից և չորս նուկլեոտիդներից՝ ադենին (A), ցիտոզին (C), գուանին (G) և թիմին (T): Որոշ ֆագերում թիմինը փոխարինվում է Uracil-ով (PBS1 ֆագ), որը սովորաբար ներառված է ՌՆԹ-ում։ ԴՆԹ-ի երկու շղթաների նուկլեոտիդները միացված են ջրածնային կապերով՝ ըստ կոմպլեմենտարության սկզբունքի՝ A-T, G-C պուրիններ (2 օղակ) -Ադենին, Գուանի պիրիմիդիններ -Թիմին, Ցիտոզին |
dDNA=20A; - պուրին-12Ա-ի համար, պիրիմիդին-8A-ի համար |
A-T զույգում կա 2 H-կապ, G-C զույգում` 3 |
Պտտվող ԴՆԹ մոլեկուլ
Հիմքի տավտոմերիզմ
Հետերոցիկլետներում ազոտի հետ կապված պրոտոնները կարող են անցնել
ազոտի այլ ատոմների կամ keto խմբի թթվածնի ատոմների վրա, իսկ լուծույթներում կլինի տարբեր տավտոմերային կառուցվածքների հավասարակշռություն, որոնք արագ փոխակերպվում են միմյանց:
Տավտոմերային փոխակերպումների արդյունքում U և G-ն էնոլ ձևով կարող են ընդօրինակել C-ն և A-ն զուգավորման ժամանակ, իսկ C-ն և A-ն իմինո ձևով կարող են ընդօրինակել U և G-ն, ինչը կարող է հանգեցնել ԴՆԹ-ի մուտացիաների (նկ.):
Խաղադրույքի փոխազդեցություն
ԴՆԹ-ի շղթայում հիմքերը ընկած են իրար վրա՝ մի կույտով, որն ապահովում է շղթայի հավելյալ կայունացում՝ ստաքինգ փոխազդեցություն:
Հիմքերի միջև կուտակված փոխազդեցության արժեքը՝ պուրին-պուրին>պիրիմիդին-պուրին>պիրիմիդին-պիրիմիդին
Օլիգո- և պոլինուկլեոտիդներում հարակից հիմքերի միջև կուտակումը հանգեցնում է կայուն միաշղթա պտուտակավոր կառուցվածքի (polyA) ձևավորմանը, մինչդեռ կուտակման բացակայությունը հանգեցնում է անկարգության պարույրի (polyU)
Դարձման փոխազդեցությունների էներգիան ~ -3 - -15 կկալ/մոլ
Շաքարաֆոսֆատային ողնաշարը հիմքից դուրս՝ դեզօքսիրոբոզային ֆոսֆատների ներսում միացված են ֆոսֆոդիստերային կապերով։ Ֆոսֆատի OH խմբերը միացված են
OH խմբով դեզօքսիռիբոզի 3" և 5" ածխածինների վրա:
Անհամապատասխանությունը կարող է առաջանալ, երբ թիմինը գտնվում է էնոլ ձևի մեջ կամ ցիտոսինը՝ իմինո ձևի:

Նուկլեոտիդային փոփոխություններ

նկ.1 Փոփոխված նուկլեոտիդներ[Երգչուհի].

ԴՆԹ-ի նուկլեոտիդները կարող են ենթարկվել փոփոխությունների՝ 5-մեթիլցիտոզին,
5-հիդրօքսիմեթիլցիտոզին, 5-հիդրօքսիմեթիլուրացիլ,
N-մեթիլադենին. Որոշ բակտերիոֆագների ԴՆԹ-ում մոնո- կամ դիսաքարիդները կցվում են հիդրօքսիմեթիլցիտոզինի հիդրօքսիմեթիլ խմբին գլիկոզիդային կապի միջոցով։ Ստորին էուկարիոտների և անողնաշարավորների մեծ մասի ԴՆԹ-ն պարունակում է համեմատաբար քիչ 5-մեթիլցիտոզին և
N6-մեթիլադենին: Ողնաշարավորների մոտ բազային մեթիլացումը խաղում է
Կարևոր դեր է գեների էքսպրեսիայի կարգավորման գործում, որտեղ 5-մեթիլցիտոզինը ամենատարածվածն է: Ցույց է տրված, որ
Ողնաշարավորների ԴՆԹ-ի մեթիլային խմբերի ավելի քան 95%-ը պարունակվում է հազվագյուտ CG դինուկլեոտիդների ցիտոզինի մնացորդներում, և այդ դինուկլեոտիդների ավելի քան 50%-ը մեթիլացված է: Բույսերի մեջ 5-մեթիլցիտոզինը կարող է հայտնաբերվել CG դինուկլեոտիդներում
և CNG տրինուկլեոտիդներ (N – C, A կամ T):

ԴՆԹ-ի ձևերը

Ընտրանքներ	B-ձև	Ա-ձև	C-ձև	Z-ձև
Պարույր	աջլիկ	աջլիկ	աջլիկ	ձախլիկ
միավորներ կրկնել	Երկուշաբթի 1	1 ամս	1 ամս	2 ամս
շրջանառության մեջ գտնվող մոն	10,4	10,7	9.3	12
տրամագիծը	23.7A	25.5 Ա		18.4A
ռոտացիա/երկ	35,9	33,6	38,7	60/2
mon-ի թեքությունը դեպի առանցքը	-1,2	+19		-9
ռաստ. m-y mon առանցքի երկայնքով	0,332 նմ	0,23 նմ		0,38 նմ
շրջադարձի երկարությունը	34Ա	28Ա	31Ա	34.4 Ա

ԴՆԹ-ի տարբեր մեթոդներով ուսումնասիրելիս հայտնաբերվել է տարբեր պայմաններում ձևավորված ԴՆԹ-ի տարբեր ձևերի առկայություն (աղի կոնցենտրացիաներ, խոնավություն), որոնցից մի քանիսն ունակ են գոյություն ունենալ կենդանի օրգանիզմներում։

Կան ԴՆԹ-ի ձևերի A, B, C, D, T-ընտանիքներ, որոնք կարելի է բաժանել տարբեր ենթատեսակների (C, C»»)։
Բ-ԴՆԹ- ԴՆԹ-ի հիմնական վիճակը, որը ցուցադրվում է բյուրեղների և ջրային լուծույթների վրա:
C-ԴՆԹ- ձևը, որն առկա է Na-ի նվազեցված կոնցենտրացիայի և 44-66% խոնավության դեպքում, եթե GC=31-72%:
Ա-ԴՆԹ- այս ձևը ձևավորվում է ԴՆԹ-ՌՆԹ հիբրիդներում, հետևաբար, տրանսկրիպցիայի ընթացքում ԴՆԹ-ն անցնում է A- ձևի, ՌՆԹ-պոլի շփման վայրում: Այս ձևը բնութագրվում է 5 Ա տրամագծով ներքին դատարկության առկայությամբ:

Զ-ԴՆԹ- ձախակողմյան ձև B-->Z անցումը հեշտանում է GC-5" հաջորդականության առկայությամբ, որը օրգանիզմների մեթիլացման վայրն է: Նման հաջորդականությունները պլազմիդներում գերոլորման ժամանակ փոխվում են B-ից Z ձևով:
B-->Z անցումում 11-bp հատվածն ունի անցումային ձև ձախ և աջ պարույրի միջև:
Z-ԴՆԹ հայտնաբերվել է D. melanogaster-ի պոլիտենային քրոմոսոմների միջերեսներում:

GC-5" պոլինուկլեոտիդը, լինելով B- ձևի մեջ, կազմում է նուկլեոսոմներ աղի ցածր կոնցենտրացիաների դեպքում, աղի բարձր կոնցենտրացիաների դեպքում GC-5" պոլինուկլեոտիդը անցնում է Z ձևի, որը չի առաջացնում նուկլեոսոմներ:
A-, Z- ձևերը չեն կարող գոյություն ունենալ ջրային լուծույթում առանց լրացուցիչ ազդեցությունների (սպիտակուցներ, գերոլորում):

Դ-ԴՆԹ- T2 ֆագի ԴՆԹ-ի AT-ով հարուստ շրջաններ, որոնցում ցիտոսինը փոխարինվում է 5"-հիդրօքսիմեթիլցիտոզինով, միակ հայտնի բնական ԴՆԹ-ն D- ձևն է: Բացի այդ, ֆագի ԴՆԹ-ն գլիկոզիլացված է ավելի քան 70%:
D-DNA-ի կրկնակի պարույրն ավելի ոլորված է, քան B-DNA-ն և ունի խորը փոքր ակոս՝ հարմար խոռոչ ջրի և կատիոնների համար:

3D ԴՆԹ կառուցվածքներ

ԴՆԹ կորություն

ԴՆԹ-ի նուկլեոտիդային կազմը

Չարգաֆի կանոնները
Որոշների ԴՆԹ-ի նուկլեոտիդային կազմը
օրգանիզմներ[Երգչուհի].

Աղբյուր	ԲԱՅՑ	Գ	Գ	Տ	A+T/G+C	A+G/T+C	G+C, մոլ.%
Բակտերիոֆագ λ Բակտերիոֆագ T2 Էշերիխիա կոլի Bacillus subtilis Shoup-ի պապիլոմա վիրուս Saccharomyces cerevisiae Քլամիդոմոնաս ծիտ Մուկ Կով Ցորեն	26,0 32,5 23,8 29,0 26,6 31,3 19,6 27,9 28,9 27,3 27,2	23,8 18,2 26,0 20,7 24,5 18,7 30,2 21,2 21,1 22,5 22,6	24,3 16,72 26,4 21,3 24,2 17,1 30,0 21,5 20,3 22,5 22,8	25,8 32,6 23,8 29,0 24,7 32,9 19,7 29,4 30,0 27,7 27,4	1,08 1,86 0,91 1,38 1,05 1,79 0,65 1,34 1,44 1,22 1,20**	0,99 1,03* 0,99 0,99 1,04 1,00 0,99 0,96 1,00 0,99 0,99**	48 35* 52 42 49 36 60 43 41 44 45**

* 5-հիդրօքսիմեթիլցիտոզին
** ներառյալ 5-մեթիլցիտոզինը

Էուկարիոտների մոտ 5"-CG-3"-ի առաջացման հաճախականությունը ավելի բարձր է, քան 5"-GC-3", քանի որ. Դինուկլեոտիդ 5"-GC-3" ենթարկվում է մեթիլացման, որը ներգրավված է գեների արտահայտման կարգավորման մեջ: Պրոկարիոտների մոտ 5'-CG-3'/5'-GC-3' հարաբերակցությունը մոտ է պատահականությանը (տես աղյուսակը):

ԴՆԹ-ի մոլեկուլների չափը

ԴՆԹ-ի չափը արտահայտվում է բազային զույգերով (bp) կամ հազար բազային զույգերով (bp)

Աղբյուր

Մ, այո

Երկարություն

Երկ

Կառուցվածքի տեսակը

Բակտերիոֆագ φX174
SV40
Բակտերիոֆագ T2
Hemophilus influenzas-ի քրոմոսոմ
Escherichia coli քրոմոսոմ
Saccharomyces cerevisiae
Քրոմոսոմ 1
Քրոմոսոմ 12
Drosophila melanogaster
Քրոմոսոմ 2
Քրոմոսոմ 3
Քրոմոսոմ 4

1,6 10 6
3,5 10 6
1,2 10 8
7,9 10 8
2,6 10 8

1,4 10 8
1,5 10 9

4 10 10
4,2 10 10
4 10 9

1,6 մկմ
1,1 մկմ
50 մկմ
300 մկմ
1 մմ

50 մկմ
500 մկմ

15 մմ
16 մմ
1,5 մմ

5 10 3
5,2 10 3
2 10 5
1,2 10 6
4 10 6

2,1 10 5
2,2 10 6

6,0 10 7
6,3 10 7
6 10 6

Շրջանաձև մեկ շղթա
Շրջանաձև կրկնակի շղթա
Գծային կրկնակի շղթա
անհայտ
Շրջանաձև կրկնակի շղթա

Գծային կրկնակի շղթա
Գծային կրկնակի շղթա

Գծային կրկնակի շղթա
Գծային կրկնակի շղթա
Գծային կրկնակի շղթա

ԴՆԹ-ի հալեցում

Դենատուրացիակամ հալվելը- ԴՆԹ-ի շղթաների շեղում, երբ ԴՆԹ-ն տաքացվում է մինչև 1000C կամ երբ pH-ն ավելանում է:
Շղթաների շեղումը տեղի է ունենում թույլ ջրածնի ոչնչացման պատճառով
կապերը և հիմքերի միջև հարթ փոխազդեցությունները:
Դենատուրացիայի վրա ազդում են նաև՝ միաձույլ և երկվալենտ մետաղների իոնները, սպիտակուցները, որոնք չեզոքացնում են ֆոսֆատ խմբերի բացասական լիցքերը։
GC-ի հալման կետը բարձր է AT-ից. AT զույգերի երկու H կապերը կոտրելու համար ավելի քիչ էներգիա է պահանջվում, քան GC զույգերի երեք H կապերը կոտրելու համար: ջերմաստիճանը և pH-ի արժեքները, որոնց դեպքում տեղի է ունենում դենատուրացիա, կախված են ԴՆԹ-ի նուկլեոտիդային կազմից:
ԴՆԹ-ի հալման կորը
Դենատուրացիան շրջելի գործընթաց է, կրկնակի շղթա ԴՆԹ-ի կառուցվածքի հետագա վերականգնումը կարող է տեղի ունենալ նույնիսկ շղթաների լիակատար շեղման դեպքում: Վերամիավորման գործընթացը, որը կոչվում է ռենատուրացիա, ռեասոցիացիա կամ կռում, տեղի է ունենում, երբ
ջերմաստիճանի կամ pH-ի անկում
Ջերմաստիճանի կամ pH-ի կտրուկ նվազման դեպքում կոմպլեմենտար շղթաների ճիշտ վերամիավորումը դժվար է զուգավորման պատճառով:
տեղական փոխլրացնող շրջանների հիմքերը նույն կամ տարբեր շղթաներով:

ԴՆԹ-ի վերափոխումը տեղի է ունենում հալման կետից ~200C ցածր ջերմաստիճանում:
Վերականգնման ժամանակ կրկնվող ԴՆԹ-ով շղթայական հատվածները սկզբում միացվում են, իսկ հետո՝ եզակի հատվածներով։
ԴՆԹ-ի վերափոխման կորը
t հալվել ընդդեմ կոն. աղ

ԴՆԹ-ի հատկությունները

Ուլտրաձայնը կտրում է ԴՆԹ-ն հավասար բեկորների՝ ~500 bp երկարությամբ:
ԴՆԹ-ն անլուծելի է ոչ բևեռային լուծիչներում:
Ալկալին հիդրոլիզացնում է ԴՆԹ-ն:
Ֆոսֆատային խմբերի լիցքի պատճառով ԴՆԹ-ն բացասական լիցք ունի։

ԴՆԹ մոլեկուլների տոպոլոգիա

Գրականություն:

Երգիչ. Genes and genomes v.1
Zenger.V. Նուկլեինաթթուների կառուցվածքային կազմակերպման սկզբունքները. Մ., Միր, 1987

1944 թվականին Էյվերիի, ՄաքԼեոդի և Մաքքարթիի փորձերը ցույց տվեցին, որ պնևմոկոկի մուտանտ ակապսուլյար շտամում պարկուճ ձևավորելու ունակությունը կարող է վերականգնվել՝ դրա բջիջներ ներմուծելով մաքրված պնևմակոկային ԴՆԹ, որը կարող է պարկուճ արտադրել: Հեղինակները այս փոփոխության համար պատասխանատու գործակալին (ԴՆԹ) անվանել են «փոխակերպող գործոն»։ Շատ շուտով փոխակերպման մեթոդը լայնորեն կիրառվում է գենետիկական հետազոտություններում։ Համեմատաբար վերջերս փորձեր են իրականացվել, որտեղ խմորիչ բջիջները, կաթնասունների բջիջները, կրծողների և միջատների սաղմերը ծառայել են որպես ստացող, իսկ կլոնավորված ԴՆԹ-ն ծառայել է որպես գենետիկ տեղեկատվության դոնոր:

ԴՆԹ-ի քիմիական հատկությունները

ԴՆԹ ձևավորող մոնոմերային միավորների քիմիական բնույթը (դեզօքսյադենիլատ, դեզօքսիցիտիդիլատ, դեզօքսիգուանիլատ և թիմիդիլատ) նկարագրված է Գլ. 34. Մոնոմերները պոլիմերացվում են 3, 5-ֆոսֆոդիստերային կապերի առաջացմամբ՝ առաջացնելով ԴՆԹ-ի մեկ շղթա (նկ. 37. 1): ԴՆԹ-ում տեղեկատվությունը գրվում է պուրինային և պիրիմիդին դեզօքսիռիբոնուկլեոտիդների հատուկ հաջորդականության տեսքով:

Պոլիմերային ԴՆԹ մոլեկուլը, ինչպես երևում է նկարից, բևեռային է։ Մի ծայրում 5-հիդրօքսիլ է (կամ ֆոսֆատ խումբ), մյուսում՝ 3-ֆոսֆատ (կամ հիդրօքսիլ խումբ): Հիմք ընդունելով ԴՆԹ-ի ռենտգենյան դիֆրակցիոն անալիզի տվյալները և Չարգաֆֆի կանոնը, ըստ որի ԴՆԹ-ի մոլեկուլում դեզօքսյադենոզինի (A) մնացորդների պարունակությունը հավասար է թիմիդինի (T), իսկ դեզօքսիգուանոզինի (G) պարունակությանը։ ) հավասար է դեզօքսիցիտոզինի (C), Ուոթսոնի, Քրիքի և Ուիլկինսի պարունակությանը, որն առաջարկվել էր 50-ական թվականների սկզբին ԴՆԹ-ի երկշղթա կառուցվածքի մոդելի վրա: ԴՆԹ-ի B ձևի մոդելը ներկայացված է նկ. 37.2. Այս աջակողմյան, կրկնակի շղթա մոլեկուլի երկու շղթաները միմյանց պահում են պուրինային և պիրիմիդինային հիմքերի միջև ձևավորված ջրածնային կապերով։ Կոմպլեմենտար զույգերի ձևավորումը խիստ սպեցիֆիկ է։ Ա-ն միշտ զուգավորում է (նկ. 37. 3):

Կրկնաշղթա մոլեկուլում սահմանափակումներ՝ պայմանավորված ֆոսֆոդիստերային կապի շուրջ պտույտի արգելակմամբ, գլիկոզիդային կապերի գերակշռող «ավտոկոնֆիգուրացիայով» (նկ. 34.9) և չորս հիմքերի (A, G, T և C) գերակշռող տավտոմերային ձևերով։ , նկ. 34.3) ստեղծել պայմաններ, որոնց դեպքում A-ն կարող է ամուր զույգ կազմել միայն T-ի, իսկ G-ն միայն C-ի հետ (նկ. 37.3): Ահա թե ինչ է բացատրում Չարգաֆֆի կանոնները (A = T; G = C): Կրկնակի պարույրի երկու շղթաները, լինելով բևեռային, և

Բրինձ. 37.1. ԴՆԹ-ի մոլեկուլի կառուցվածքի մի հատված, որում պուրինի և պիրիմիդինի հիմքերը ադենինը (A), թիմինը (T), ցիտոսինը (C) և գուանինը (G) պահվում են ֆոսֆոդիստերային ողնաշարի միջոցով, որը միացնում է դեզօքսիռիբոսիլ մնացորդները՝ կապված - գլիկոզիդային կապը համապատասխան նուկլեինային հիմքերի հետ: Խնդրում ենք նկատի ունենալ. ԴՆԹ-ի մեկ շղթայի ֆոսֆոդիստերային ողնաշարն ունի «բևեռականություն» (այսինքն, դրանում կարելի է առանձնացնել որոշակի ուղղություն, օրինակ):

հակազուգահեռ, այսինքն՝ մի շրջանի և մյուսի ուղղությունը։ Նման պատկերը հիշեցնում է երկու զուգահեռ փողոցներ՝ միակողմանի երթեւեկությամբ՝ ուղղված հակառակ ուղղություններով։ ԴՆԹ-ի երկու կոմպլեմենտար շղթաներից մեկը, որը պարունակում է տեղեկատվություն որոշակի գենի կառուցվածքի մասին հատուկ նուկլեոտիդային հաջորդականության տեսքով, սովորաբար կոչվում է կոդավորում (կամ ձևանմուշ); դրան լրացնող մյուս շղթան կոչվում է ոչ կոդավորում:

Ինչպես ցույց է տրված նկ. 37.3, երեք ջրածնային կապեր են ձևավորվում դեզօքսիգուանոզինի և դեզօքսիցիտիդինի մնացորդների միջև, և միայն երկուսը թիմիդինի և դեզօքսյադենոզինի միջև: Հետեւաբար, G-C կապն ավելի ամուր է մոտ 50%-ով: Այս հանգամանքը, ինչպես նաև կուտակված փոխազդեցությունները, կարող են բացատրել GC-ով հարուստ ԴՆԹ շրջանների ավելի բարձր դենատուրացիայի (հալման) ջերմաստիճանը:

ԴՆԹ-ի կառուցվածքը

ԴՆԹ-ն կարող է ձևավորել մի քանի տեսակի կրկնակի պարույրներ։ Ներկայումս արդեն հայտնի է վեց ձև (A-ից մինչև E և Z-ձև): ԴՆԹ-ի կառուցվածքային տարբերակների մեծ մասը կարող է գոյություն ունենալ միայն խիստ վերահսկվող փորձարարական պայմաններում: Այս տարբերակները տարբերվում են 1) կրկնակի պարույրի մեկ պտույտի համար հիմքերի զույգերի քանակով. 2) հիմքերի զույգերի հարթությունների հեռավորությունը և պարույրի առանցքի հետ ձևավորվող անկյունը. 3) պարույրի տրամագիծը. 4) կրկնակի պարույրի կողմնորոշումը (աջ, ձախ) (Աղյուսակ 37. 1):

Այս ձևերից մի քանիսը փոխվում են միմյանց՝ աղի կոնցենտրացիայի և խոնավացման աստիճանի փոփոխությամբ: Հնարավոր է, որ անցումներ ԴՆԹ-ի տարբեր կառուցվածքային ձևերի միջև տեղի ունենան նաև in vivo-ում:

Բրինձ. 37.2. Ուոթսոնի և Կրիկի մոդելը B-աձև կրկնակի պարուրաձև կառուցվածքի մասին։ Ձախ՝ մոլեկուլի սխեմատիկ ներկայացում (A - ադենին, C - ցիտոզին, G - գուանին, T - թիմին, P - ֆոսֆատ, S- շաքար [դեզօքսիրիբոզ]): Աջ՝ ԴՆԹ կառուցվածքի մոդել: (Լուսանկարը J.D. Watson-ից, Molecular biology of the Gene 3rd ed. Copyrght 1976, 1970, 1965 by W. A. Benjamin, Inc., Menlo Park, Calif.)

Ֆիզիոլոգիական պայմաններում (աղի ցածր կոնցենտրացիան, խոնավության բարձր աստիճանը) ԴՆԹ-ի կառուցվածքային գերիշխող տեսակը B- ձևն է։ Նման մոլեկուլի պարույրի քայլը 3,4 նմ է։ ԴՆԹ-ի կծիկը կարող է ներկայացվել որպես երկու ոլորված «մետաղադրամներ»՝ յուրաքանչյուրում 10 հատ: Կույտերը իրար են պահվում ջրածնային կապերով՝ կույտերի երկու հակադիր «մետաղադրամների» միջև և «փաթաթված» են ֆոսֆոդիստերային ողնաշարի երկու ժապավեններով, որոնք ոլորված են աջակողմյան պարույրի մեջ։ Ավելի քիչ բարձր հիդրատացիայի և Na + կամ K + իոնների ավելի բարձր պարունակության պայմաններում առաջանում է մի փոքր այլ կառուցվածք՝ այսպես կոչված A- ձև։ Այս աջակողմյան կոնֆորմացիան ունի ավելի մեծ պարույրի տրամագիծ, քան B ձևը և ավելի մեծ թվով բազային զույգեր մեկ պտույտում: Այն նման է երկշղթա ՌՆԹ-ին կամ ՌՆԹ-ԴՆԹ-ի դուպլեքսներին բնորոշ կառուցվածքին։ C-E ձևերը նույնպես աջակողմյան են, դրանց ձևավորումը կարելի է դիտարկել միայն հատուկ փորձերի ժամանակ, և, ըստ երևույթին, դրանք գոյություն չունեն in vivo-ում։

Z-ձև. ԴՆԹ-ն ձախակողմյան կրկնակի խխունջ է, որի մեջ ֆոսֆոդիստերային ողնաշարը մոլեկուլի առանցքի երկայնքով զիգզագ է։ Այստեղից էլ առաջացել է մոլեկուլի անվանումը (զիգզագ)-ԴՆԹ։ Z-DNA-ն ամենաքիչ ոլորվածն է (12 բազային զույգ մեկ պտույտում) և բնության մեջ հայտնի ամենաբարակը, այն ունի միայն մեկ ակոս (տես ստորև): Z-ԴՆԹ-ն հայտնաբերվում է փոփոխական պուրինային և պիրիմիդին դեզօքսինուկլեոտիդների (GC կամ AC) կրկնվող հաջորդականություններում՝ մի շարք այլ կայունացնող գործոնների առկայության դեպքում: Դրանք ներառում են. 2) ԴՆԹ-ի մոլեկուլում բացասական սուպերոլորերի բարձր պարունակություն (տես գլ. 38); 3) Z-DNA հատուկ սպիտակուցների միացում. 4) որոշ դեզօքսիցիտիդինի մնացորդների ածխածնի-5 ատոմի մեթիլացում.

Z-ձևի ԴՆԹ-ն կարող է ներգրավվել գեների արտահայտման կարգավորման մեջ, ինչպես մոտ տեղակայված, այնպես էլ Z- կայքից զգալիորեն հեռու: Որոշ սպիտակուցներ, որոնք կապվում են B- ձևի ԴՆԹ-ի հիմնական կամ փոքր ակոսներում, ամենայն հավանականությամբ չեն կարող միանալ ԴՆԹ-ի Z ձևին: Բացի այդ, ԴՆԹ-ի մի հատվածի վերադարձը Z-ձևից ԴՆԹ-ի B-ձևի, որն առաջանում է, օրինակ, β-մեթիլդեօքսիցիտիդինի կողմից մեթիլ խմբերի կորստի հետևանքով։ կարող է ազդել ԴՆԹ-ի հատվածների ոլորման կարգավիճակի վրա, որոնք գտնվում են ռեվերսիոն տարածքից զգալի հեռավորության վրա:

Բրինձ. 37.3. Դեզօքսյադենոզինային և թիմիդինային հիմքերի միջև երկու ջրածնային կապի (կտրված գիծ) և դեզօքսիգուանոզինի և դեզօքսիցիտիդինի հիմքերի միջև երեք ջրածնային կապի ձևավորում (ներքևում): ԴՆԹ-ում ածխաջրերի մնացորդը 2-դեօքսիրիբոզ է, ՌՆԹ-ում՝ D-ռիբոզ

Պտտվող շրջադարձային ԴՆԹ-ն, ինչպես նաև դեզօքսիցիտիդինի մեթիլացումը, հավանաբար, ազդում են գեների ակտիվության վրա (տես ստորև):

Z-DNA-ի առկայությունը Drosophila-ի (մրգաճանճ) քրոմոսոմներում ցուցադրվել է ԴՆԹ-ի Z- ձևին հատուկ հակամարմինների միջոցով: Մարդու ԴՆԹ-ում կան տարածքներ, որոնք պոտենցիալ ունակ են փոխակերպվել Z- ձևի. դրանք ցրված են գենոմում։

Աղյուսակ 37.1. ԴՆԹ-ի կառուցվածքների որոշ տեսակների բնութագրում

Հիմքեր կան ենթադրելու, որ Z- ձևի կայունացման համար անհրաժեշտ պայմանները կարող են իրականացվել նաև մարդու բջիջներում:

ԴՆԹ-ի դենատուրացիա (հալում):

ԴՆԹ-ի երկշղթա կառուցվածքը կարելի է «հալեցնել» լուծույթում՝ բարձրացնելով ջերմաստիճանը կամ նվազեցնելով աղի կոնցենտրացիան։ Հալման ժամանակ ոչ միայն ԴՆԹ-ի շղթան շեղվում է, այլ նաև խաթարվում է այս շղթայի ներսում նուկլեինային հիմքերի փոխազդեցությունների կուտակման համակարգը: Ֆոսֆոդիստերային կապերն այս դեպքում չեն կոտրվում։ ԴՆԹ-ի դենատուրացիան ուղեկցվում է պուրինային և պիրիմիդինային հիմքերի օպտիկական կլանման ավելացմամբ։ Այս երեւույթը կոչվում է ԴՆԹ-ի դենատուրացիայի հիպերքրոմային էֆեկտ։ Դենատուրացիան նաև վերացնում է բնիկ ԴՆԹ-ի լուծույթներին բնորոշ բարձր մածուցիկությունը, որի մանրաթելանման կառուցվածքը պայմանավորված է ինչպես յուրաքանչյուր շղթայում նուկլեինային հիմքերի փոխազդեցությամբ, այնպես էլ երկու շղթաների միջև փոխլրացնող փոխազդեցությամբ:

Տվյալ ԴՆԹ-ի մոլեկուլի շղթաների բաժանումը տեղի է ունենում որոշակի ջերմաստիճանի միջակայքում։ Այս միջակայքի միջնակետը կոչվում է ԴՆԹ-ի հալման կետ կամ . Արժեքը կախված է ԴՆԹ-ի նուկլեոտիդային կազմից և լուծույթում աղի կոնցենտրացիայից: G-C զույգերով հարստացված ԴՆԹ-ի մոլեկուլները (դրանք միացված են երեք ջրածնային կամուրջներով) «հալվում են» ավելի բարձր ջերմաստիճանում, քան A-T-ով հարուստ մոլեկուլները (A-T զույգերը կապված են երկու ջրածնային կամուրջներով): Միավալենտ կատիոնների կոնցենտրացիայի տասնապատիկ աճը մեծանում է 16,6 °C-ով: Formamide-ը, որը սովորաբար օգտագործվում է ռեկոմբինանտ ԴՆԹ-ի հետ փորձարկումներում, ապակայունացնում է ջրածնային կապերը հիմքերի միջև՝ դրանով իսկ նվազեցնելով . Սա թույլ է տալիս ԴՆԹ-ի կամ ԴՆԹ-ՌՆԹ հիբրիդի շղթաները շեղվել ավելի ցածր մակարդակով, ինչը նվազեցնում է բարձր ջերմաստիճանում առանձին շղթաների ճեղքման հավանականությունը:

ակոսներ ԴՆԹ-ի կառուցվածքում

Նկ.-ում ներկայացված մոդելն ուսումնասիրելիս: 37.2, կարելի է ուշադրություն դարձնել ԴՆԹ-ի կառուցվածքում հիմնական և փոքր ակոսների առկայությանը, որոնք ոլորված են ֆոսֆոդիստերային ողնաշարին զուգահեռ մոլեկուլի առանցքի շուրջը: Այս ակոսներում սպիտակուցները կարող են հատուկ փոխազդել նուկլեինային հիմքերի որոշ ատոմների հետ և, հետևաբար, «ճանաչել» հատուկ նուկլեոտիդային հաջորդականություններ՝ առանց կրկնակի պարույրի կառուցվածքում փոխլրացնող փոխազդեցությունների խանգարման։ Ինչպես ցույց կտա Գլուխ. 39 և 41, հենց այդպիսի փոխազդեցությունների միջոցով է, որ կարգավորող սպիտակուցները կարող են վերահսկել գեների արտահայտությունը:

Հանգիստ և գերոլորված ԴՆԹ

Որոշ օրգանիզմների՝ բակտերիաների, բակտերիոֆագների և շատ կենդանիների ԴՆԹ վիրուսների ԴՆԹ-ն փակ շրջանաձև կառուցվածք է։ Իհարկե, նման կառուցվածքը չի խախտում մոլեկուլների բևեռականությունը, բայց դրա մեջ անհետանում են ազատ և հիդրոքսիլ և ֆոսֆորիլ խմբերը։ Փակ օղակները կարող են գոյություն ունենալ հանգիստ կամ գերոլորված ձևերով: Գերոլորումը դրսևորվում է, երբ փակ օղակը պտտվում է իր առանցքի շուրջ կամ երբ ոլորվում է գծային ԴՆԹ-ի մի հատված, որի ծայրերը ամրացված են։ Էներգիա պահանջող այս գործընթացը հանգեցնում է կառուցվածքի ներմոլեկուլային լարվածության առաջացմանը։ Գերոլորիկների քանակի ավելացման հետ մեկտեղ մեծանում է ներքին (ոլորման) լարվածությունը (սա ստուգեք սովորական ռետինե ժապավենի վրա): ԴՆԹ-ի սուպերոլորները, որոնք առաջացել են ժամացույցի սլաքի ուղղությամբ պտտվելուց (ԴՆԹ-ի B ձևի աջակողմյան կրկնակի պարույրի ոլորման հակառակ ուղղությամբ) կոչվում են բացասական։ Ինչ-որ իմաստով կարելի է ենթադրել, որ նման կառուցվածքային վիճակի հասնելու համար անհրաժեշտ էներգիան պահվում է սովորական (ոչ բացասական) գերոլորերում։ ԴՆԹ-ի մոլեկուլի մեկ այլ տեսակի գերմոլեկուլային կառուցվածքի անցման էներգիան կարող է կրճատվել բացասական շրջադարձային շրջանների ձևավորման պատճառով: Նման անցումներից մեկը շղթայի բաժանումն է՝ կրկնօրինակման և տառադարձման նախապատրաստման համար: Ահա թե ինչու ԴՆԹ-ի սուպերոլորումը շատ օգտակար է կենսաբանական համակարգերում: ԴՆԹ-ի մոլեկուլում տոպոլոգիական փոփոխությունները կատալիզացնող ֆերմենտները կոչվում են տոպոիզոմերազներ: Դրանցից ամենաուսումնասիրվածը բակտերիալ գիրազն է, որը սկիզբ է դնում բացասական գերոլորիկների առաջացմանը։

ԴՆԹ-ի գործառույթը

Նուկլեոտիդային հաջորդականության մեջ կոդավորված գենետիկական տեղեկատվությունը երկու նպատակի է ծառայում. Նախ՝ այն անհրաժեշտ է սպիտակուցի մոլեկուլների սինթեզի համար, և երկրորդ՝ ապահովում է իր տեղափոխումը մի շարք բջիջների սերունդների և օրգանիզմների սերունդների մեջ։ Երկու գործառույթներն էլ հիմնված են այն փաստի վրա, որ ԴՆԹ-ի մոլեկուլը ծառայում է որպես ձևանմուշ. առաջին դեպքում՝ տրանսկրիպցիայի համար՝ տեղեկատվության վերակոդավորում ՌՆԹ-ի մոլեկուլների կառուցվածքում, իսկ երկրորդում՝ վերարտադրման համար՝ դուստր ԴՆԹ-ի մոլեկուլներում տեղեկատվության պատճենումը:

Ուոթսոնի և Կրիկի կրկնակի պարուրաձև շղթաների փոխլրացումը ենթադրում է ԴՆԹ-ի կրկնօրինակման կիսապահպանողական եղանակ: Սա նշանակում է, որ շղթաները տարբերվում են և յուրաքանչյուրը ծառայում է որպես նոր լրացնող հաջորդականության սինթեզի ձևանմուշ (նկ. 37.4): Ստացված երկու երկշղթա ԴՆԹ մոլեկուլները, որոնցից յուրաքանչյուրը բաղկացած է մեկ ծնողից և մեկ նոր սինթեզված լրացուցիչ շղթայից, բաշխված են երկու դուստր բջիջների միջև (նկ. 37.5): Այսպիսով, դուստր բջիջներից յուրաքանչյուրը ստանում է ծնողական բջիջի ունեցածին նույնական տեղեկատվություն: Երկու դուստր բջիջներից յուրաքանչյուրը պահպանում է սկզբնական ծնողական ԴՆԹ-ի մեկ շարանը:

Escherichia coli բակտերիաներում վերարտադրման կիսապահպանողական մեխանիզմը միանշանակորեն ցուցադրվել է Մեսելսոնի և Ստալի դասական փորձի ժամանակ՝ օգտագործելով ազոտի ծանր իզոտոպը հավասարակշռության ցենտրիֆուգացման հետ համատեղ:

Բրինձ. 37.4. ԴՆԹ-ի կրկնակի շղթա կառուցվածքը. ԴՆԹ-ի մայր մոլեկուլի երկու շղթաներից յուրաքանչյուրն օգտագործվում է որպես նոր լրացնող շղթաների սինթեզի ձևանմուշ։ (J. D. Watson. Molecular biology of the Gene 3rd ed. Copyright 1976, 1970, 1965 by W. A. Benjamin, Inc., Menlo Park,

Բրինձ. 37.5. ԴՆԹ-ի շղթաների ակնկալվող բաշխումը կիսապահպանողական և պահպանողական վերարտադրության մեջ: Նկարում մայր շղթաները սև են, իսկ նոր շղթաները՝ բաց: (Վերագծված և վերարտադրված՝ Lehninger A. L. Biochemistry 2nd. ed., Worth, 1975 թ.) թույլտվությամբ:

E. coli-ի ԴՆԹ-ն և մարդու ԴՆԹ-ն քիմիապես նույնական են, թեև, իհարկե, դրանց նուկլեոտիդային հաջորդականությունները տարբեր են, և բացի այդ, մարդու բջիջը պարունակում է մոտ 1000 անգամ ավելի շատ ԴՆԹ, քան բակտերիալը։ Պարզվեց, որ ԴՆԹ-ի վերարտադրման քիմիական մեխանիզմը նույնն է պրոկարիոտների, օրինակ՝ E. coli-ի և էուկարիոտների, այդ թվում՝ մարդկանց մոտ, չնայած այն հանգամանքին, որ այդ գործընթացներում ներգրավված ֆերմենտները տարբերվում են պրոկարիոտ և էուկարիոտ բջիջներում: Բոլոր հիմքերը կան ենթադրելու, որ պրոկարիոտ օրգանիզմների նուկլեինաթթուների քիմիայի ուսումնասիրության ընթացքում ստացված տվյալները կիրառելի են նաև էուկարիոտ համակարգերի համար։ Իրոք, Մեսելսոնի և Ստալիի նման կաթնասունների բջիջների հետ փորձերի արդյունքները համեմատելի են E. coli-ի վերաբերյալ ավելի վաղ ստացված տվյալների հետ:

Եթե վիրուսային կամ բակտերիալ ԴՆԹ-ի լուծույթները դանդաղ են տաքացվում, ապա դրանց մոլեկուլները դենացիա են անում բավականին որոշակի ջերմաստիճանում (նկ. 27-16): ԴՆԹ-ի բնիկ դուպլեքսից անցումը չոլորված, պատահականորեն ոլորված, դենատուրացված ձևին կարելի է հայտնաբերել ուլտրամանուշակագույն լույսի կլանման մեծացմամբ կամ ԴՆԹ-ի լուծույթի մածուցիկության նվազմամբ: ԴՆԹ-ի յուրաքանչյուր տեսակ ունի դենատուրացիայի իր ջերմաստիճանը, որը կոչվում է «հալման կետ»: Որքան մեծ է G=C զույգերի պարունակությունը ԴՆԹ-ում, այնքան բարձր է այս ԴՆԹ-ի հալման կետը: Սա բացատրվում է նրանով, որ GC զույգերն ավելի կայուն են, և դրանց տարանջատման համար ավելի շատ էներգիա է պահանջվում, քան A=T զույգերի ոչնչացման համար; դա մասամբ պայմանավորված է նրանով, որ G=C զույգերը միացված են երեք ջրածնային կապերով, իսկ A=T զույգերը՝ ընդամենը երկու:

Հետևաբար, ԴՆԹ-ի պատրաստուկի հալման կետի մանրակրկիտ որոշումը pH-ի և իոնային ուժի ֆիքսված պայմաններում կարող է տեղեկատվություն տրամադրել ԴՆԹ-ում A=T և G=C զույգերի հարաբերակցության մասին:

ԴՆԹ-ի երկրորդ ֆիզիկական հատկությունը, որը որոշվում է G=C և A=T զույգերի հարաբերակցությամբ, լողացող խտությունն է։ G=C-nap-ի ավելի բարձր պարունակությամբ ԴՆԹ-ի պատրաստուկն ունի մի փոքր ավելի մեծ խտություն, քան A=T զույգերի ավելի մեծ պարունակությամբ ԴՆԹ-ն։ ԴՆԹ-ի պատրաստուկները բարձր արագությամբ ցենտրիֆուգվում են ցեզիումի քլորիդի () խտացված լուծույթում, որի խտությունը գտնվում է ԴՆԹ-ի խտության նույն միջակայքում:

Բրինձ. 27-15։ Հիբրիդացման թեստի սկզբունքը. Տարբեր տեսակների օրգանիզմներից մեկուսացված ԴՆԹ-ի երկու պատրաստուկները տաքացվում են այնպես, որ դրանք ամբողջությամբ այլասերվեն և շղթաները շեղվեն: Երբ այս պատրաստուկները խառնվեն և դանդաղ սառչեն, յուրաքանչյուր տեսակի ԴՆԹ-ի լրացուցիչ շղթաները կգտնեն միմյանց և կծկվեն՝ ձևավորելով սովորական դուպլեքսներ: Եթե երկու ԴՆԹ-ների միջև հաջորդականությամբ զգալի հոմոլոգիա կա, ապա հնարավոր է հիբրիդային մոլեկուլների ձևավորում, որոնք մասնակի դուպլեքսներ են։ Որքան բարձր է հոմոլոգիայի աստիճանը, այնքան ավելի հավանական է հիբրիդների ձևավորումը: Խառնուրդում հիբրիդների պարունակությունը կարող է չափվել տարբեր ձևերով, մասնավորապես՝ քրոմատագրման կամ խտության գրադիենտ ցենտրիֆուգման միջոցով: Սովորաբար, չափման ընթացակարգը պարզեցնելու համար ԴՆԹ-ից մեկը պիտակվում է ռադիոակտիվ իզոտոպով:

Բրինձ. 27-16 թթ. ԴՆԹ-ի երկու պատրաստուկների դենատուրացիայի (հալման) կորը. Միջին անցումային կետին համապատասխանող ջերմաստիճանը կոչվում է հալման կետ։ Քանի որ արժեքը կախված է pH-ից և աղի կոնցենտրացիայից, միշտ անհրաժեշտ է նշել դրա չափման պայմանները:

Ցենտրիֆուգային խողովակում ցենտրիֆուգման ժամանակ ձևավորվում է խտության գրադիենտ՝ խողովակի ստորին մասում ամենաբարձր խտությամբ: Եթե դրա մեջ տեղադրվի ԴՆԹ, ապա այն նախ կշարժվի դեպի փորձանոթի հատակը, բայց հետո որոշակի դիրքում կկանգնի ու կմնա ջրի երեսին։ Այս դիրքում այն չի կարող ոչ բարձրանալ, ոչ նստել, քանի որ լուծույթի խտությունն այստեղ հավասար է դրա խտությանը: Այս մեթոդով, որն ավելի մանրամասն նկարագրված է Գլ. 28, հնարավոր է առանձնացնել ԴՆԹ-ի մոլեկուլները, որոնք տարբերվում են G=C զույգերի պարունակությամբ միմյանցից, քանի որ դրանք ունեն տարբեր լողացող խտություններ: Այս ԴՆԹ-ի լողացող խտության հիման վրա մենք կարող ենք հաշվարկել G=C և A=T զույգերի հարաբերակցությունը դրանում։

ԴՆԹ հիբրիդացում

ԴՆԹ հիբրիդացում, նուկլեինաթթվի հիբրիդացում- կապ արհեստական պայմաններումԿոմպլեմենտար միաշղթա նուկլեինաթթուներ մեկ մոլեկուլի մեջ: Ամբողջական փոխլրացման դեպքում համադրությունը հեշտ է և արագ, իսկ մասնակի ոչ կոմպլեմենտարության դեպքում դանդաղում է շղթաների միաձուլումը, ինչը հնարավորություն է տալիս գնահատել փոխլրացման աստիճանը։ Հնարավոր է ԴՆԹ-ԴՆԹ և ԴՆԹ-ՌՆԹ հիբրիդացում:

Փորձի արձանագրություն

Երկաշղթա ԴՆԹ-ն տաքացվում է համապատասխան բուֆերում: Արտաքին պայմանների փոփոխությունների պատճառով լրացուցիչ ազոտային հիմքերի միջև ջրածնային կապերը դառնում են թերմոդինամիկորեն անբարենպաստ, և շղթաները տարբերվում են:
Դենատուրացված ԴՆԹ պատրաստուկը խառնվում է այլ դենատուրացված ԴՆԹ-ի հետ:
Պատրաստուկները դանդաղ սառչում են, մինչդեռ միաշղթա ԴՆԹ-ները միացվում են միմյանց (ջրածնային կապեր են առաջանում կոմպլեմենտար հիմքերի միջև), և ձևավորվում է ԴՆԹ-ի «հիբրիդային» մոլեկուլ։

Միաշղթա ԴՆԹ-ի կռման արագության վերլուծությունը հնարավորություն է տալիս գնահատել ԴՆԹ-ի հաջորդականությունների նմանություններն ու տարբերությունները նույն տեսակի տեսակների կամ անհատների միջև:

ԴՆԹ-ի հալման կետի հաշվարկ

ԴՆԹ-ի երկրորդական կառուցվածքը կարևոր դեր է խաղում կենսաբանության, գենետիկ ախտորոշման և մոլեկուլային կենսաբանության և նանոտեխնոլոգիայի այլ մեթոդների մեջ: Հետևաբար, ԴՆԹ-ի կամ ՌՆԹ-ի մոլեկուլների հալման կետի ճշգրիտ որոշումը ամենակարևոր դերն է խաղում մոլեկուլային կենսաբանական բոլոր մեթոդներում, ինչպիսիք են նմուշների կամ օլիգոնուկլեոտիդների ընտրությունը միկրոզանգվածների համար կամ PCR պրայմերների ընտրությունը: Կարճ օլիգոնուկլեոտիդների հալման կետը հաշվարկելու համար կան մի քանի պարզ բանաձևեր: Կարճ օլիգոնուկլեոտիդի հալման կետի (Tm) կոպիտ հաշվարկ (<20 нуклеотидов) проводят по прямому подсчету количества нуклеотидов (G+C - сумма всех гуанинов и цитозинов , L - длина олигонуклеотида):

Կարճ օլիգոնուկլեոտիդի (և երկար ԴՆԹ բեկորների համար) Tm-ի հաշվարկման միջին բանաձևը՝ հաշվի առնելով K + իոնների և DMSO-ի կոնցենտրացիան.

Այնուամենայնիվ, այս հավասարումները հաշվի չեն առնում կապի սկիզբը օլիգոնուկլեոտիդային հիբրիդացման ժամանակ, հաշվի չեն առնում բուն հաջորդականության առանձնահատկությունները և օլիգոնուկլեոտիդային դուպլեքսներին բնորոշ վերջնական էֆեկտը: Հետևաբար, այս բանաձևը ավելի հարմար է, որտեղ ԴՆԹ-ի հաջորդականությունը միջին է, իսկ դուպլեքսների երկարությունը 40 նուկլեոտիդից ավելի է:

ԴՆԹ թերմոդինամիկա

Ամենատարածված մեթոդը, որն այսօր օգտագործվում է երկշղթա կամ միաշղթա ԴՆԹ-ի հալման ջերմաստիճանը հաշվարկելու համար, հիմնված է երկաստիճան թերմոդինամիկական մոդելի վրա։ Երկու լրացնող ԴՆԹ-ի մոլեկուլները A և B կամ կապված են միմյանց հետ կամ ազատ են լուծույթում («պատահական կծիկի վիճակ»): Սովորաբար ենթադրվում է, որ A և B մոլեկուլներն էլ լիովին փոխլրացնող են, ուստի դրանց հիբրիդացումը ակնհայտ է, և թույլատրվում է մեկ կամ մի քանի կոմպլեմենտար սխալներ դուպլեքսում, ներառյալ ոչ կոմպլեմենտար G-G, G-T և G-A զույգերը (տատանվող զույգեր): Միայն մեկ մոլեկուլի դեպքում ենթադրվում է, որ այն փաթեթավորվում է օղակաձև կառուցվածքի մեջ: Դուպլեքսի մեջ հիբրիդացման գործընթացը նկարագրված է բանաձևով.

որտեղ A-ն և B-ն լուծույթի տարբեր շղթաներ են («պատահական կծիկի վիճակ»), իսկ AB-ն ձևավորված դուպլեքսն է: Այս ռեակցիան շրջելի է։ Այս ռեակցիայի համար k հավասարակշռության հաստատունը սահմանվում է հետևյալ կերպ.

Հավասարակշռության հաստատունը կախված է շղթայի կոնցենտրացիայից, ջերմաստիճանից, աղի կոնցենտրացիայից, pH-ից և ռեակցիայի այլ բաղադրիչներից (օրինակ՝ գլիցերին կամ DMSO): K հաստատունը փոխվում է՝ ի պատասխան մեկ կամ երկու շղթաների ( և/կամ ) կոնցենտրացիայի փոփոխության, այնուհետև ամբողջ համակարգը արձագանքում է փոփոխություններին, այնուհետև [A], [B]-ի անհատական կոնցենտրացիաները և նույնպես փոխվում են: Օրինակ, եթե համակարգում ավելի շատ A շղթա կա, ապա կոնցենտրացիան կաճի։ Ենթադրենք, որ հավասարակշռության հաստատունը 1.81x10 6 է, իսկ շղթաների կոնցենտրացիան = = 10 -5 Մ.

Մենք փոխարինում ենք բաղադրիչները k-ի հաշվարկման բանաձևերում.

Վերադասավորումից հետո մենք ստանում ենք.

Օրինակ, այս բանաձևով փոխարինելով = 7,91x10 -6 M, ապա շղթաների կոնցենտրացիան կլինի [A] = [B] = 2,09x10 -6 M: Այսինքն, շղթաների միայն 79%-ը կմիացվի դուպլեքսով:

Հնարավո՞ր է ջերմաստիճանի փոփոխությամբ որոշել հավասարակշռության հաստատունները: Սա մեզ բերում է այնպիսի կարևոր թերմոդինամիկական պարամետրերի ըմբռնմանը, ինչպիսիք են ազատ էներգիան (dG), էնթալպիան (dH) և էնտրոպիան (dS): Ազատ էներգիայի, էնթալպիայի և էնտրոպիայի փոփոխությունները տեղի են ունենում «հիբրիդացման ջերմաստիճանից T»-ից անկարգ, պատահական վիճակի անցնելու ժամանակ։ Այս հարաբերակցությունները սահմանվում են dG = dH – TdS բանաձևով (շղթաների կոնցենտրացիայի համար [A] = [B] = = 1M), ապա Գիբսի ազատ էներգիան հաշվարկելու իդեալական բանաձևը հետևյալն է.

որտեղ T ջերմաստիճանը կելվիններով, dH° (cal/mol) և dS° (cal/mol K):

Գոյություն ունի օգտակար հարաբերություն, որը վերաբերում է Գիբսի ազատ էներգիայի փոփոխությանը քիմիական ռեակցիայի ընթացքում նրա հավասարակշռության հաստատունին.

որտեղ R-ը գազի համընդհանուր հաստատունն է (1,987կալ/մոլ Կ):

Երկու բանաձևերը համադրելով՝ ստանում ենք.

Հալման ջերմաստիճանը (T m) որոշվում է հավասարակշռության ժամանակ, երբ շղթաների կեսը միացված է միմյանց, իսկ մյուս կեսը գտնվում է ազատ վիճակում, այսինքն՝ k=1:

Պարզ օղակի հալման կետը հաշվարկվում է որպես . ԴՆԹ-ի դուպլեքսի համար անհրաժեշտ է հաշվի առնել յուրաքանչյուր շղթայի կոնցենտրացիան (մոլերով, M): Այսպիսով, եթե [A] և [B]-ը A և B մոլեկուլների կոնցենտրացիաներն են, ապա շղթաների ընդհանուր կոնցենտրացիան՝ C, հավասար է նրանց գումարին՝ [A] + [B]:

Ենթադրվում է, որ երկու շղթաների կոնցենտրացիան նույնն է [A] = [B] = C/2: Այս դեպքում,

որտեղ f = 4. Ինքնալրացուցիչ օլիգոնուկլեոտիդի համար = C և այնուհետև f = 1: Այս հալման ջերմաստիճանը որոշվում է միայն այն ժամանակ, երբ մոլեկուլների կեսը կապված են միմյանց հետ:

Ինքնալրացուցիչ օլիգոնուկլեոտիդի համար k = 1/ հետևաբար.

Ոչ կոմպլեմենտար դուպլեքսի համար, երբ ≥ , k =1/( – /2), Tm-ը հաշվարկվում է հետևյալ կերպ.

որտեղ է գերակշռող շղթայի մոլային կոնցենտրացիան (սովորաբար PCR այբբենարան) և [Bt]-ը ցածր կոնցենտրացիայի շղթայի (գենոմային ԴՆԹ) մոլային կոնցենտրացիան է:

Հալման կետի հաշվարկ

dG, dH և dS թերմոդինամիկական պարամետրերը հաշվարկվում են մոտակա հարևանի մոդելի հիման վրա: ԴՆԹ-ի երկրորդական կառուցվածքի ճշգրիտ կանխատեսումը հիբրիդացման ժամանակ՝ օգտագործելով դինամիկ ծրագրավորման ալգորիթմներ, պահանջում է բոլոր հնարավոր ջերմադինամիկական պարամետրերի տվյալների բազա յուրաքանչյուր լրացուցիչ բազային զույգի, ինչպես նաև բոլոր անհամապատասխանությունների, ազատ ծայրերի, մազակալների և օղակների համար: Կարճ օլիգոնուկլեոտիդը հաշվարկելու թերմոդինամիկական բանաձևը հիմնված է թերմոդինամիկական պարամետրերի վրա՝ էնտրոպիա dS և էնթալպիա dH, չորս նուկլեոտիդների 10 համակցություններից յուրաքանչյուրի համար (Աղյուսակ 1): Աղյուսակ 1-ում ներկայացված են մոտակա հարևանների (NN) թերմոդինամիկական պարամետրերը նուկլեոտիդային զույգերի համար 1M NaCl կոնցենտրացիայով:

Tm (°С) հաշվարկելու համար Գիբսի ազատ էներգիայի բոլոր արժեքները յուրաքանչյուր զույգի համար գումարվում են մեկ նուկլեոտիդի հավելումներով.

dG ընդհանուր = dG սկզբնական + dG համաչափություն +∑dG + dG AT վերջ

dG տեսական = 1.96 + 0 - 2.17 - 1.44 - 1.44 - 1.00 - 1.45 - 1.30 +0.05

dG տեսական = -5,35 կկալ/մոլ

Էնտրոպիայի (dH = -43,5 կկալ/մոլ) և էնթալպիայի (dS = -122,5) արժեքները հաշվարկվում են նույն կերպ.

ԴՆԹ-ի շատ դուպլեքսներ ունեն մրցակցող միաշղթա կառուցվածքներ, և դա փոխում է համակարգի հավասարակշռությունը և, որպես հետևանք, T m արժեքի նվազում բանաձևով կանխատեսված արժեքից:

Լուծման մեջ աղի ուղղումով Tm-ի հաշվարկման ընդհանուր բանաձևը հետևյալն է.

որտեղ L-ը օլիգոնուկլեոտիդի երկարությունն է, R-ը գազի հաստատունն է (1,987կալ/Կ մոլ), c-ը օլիգոնուկլեոտիդի կոնցենտրացիան է (սովորաբար 2x10−7 Մ), կալիումի իոնների կոնցենտրացիան մոլերում (սովորաբար 5x10−): 2 մ):

Աղյուսակ 1. Մոտակա հարևանների (NN) թերմոդինամիկական պարամետրերը նուկլեոտիդային զույգերի համար 1M NaCl կոնցենտրացիայում,

Զույգերի հաջորդականությունը (5"-3"/3"-5")	° կկալ/մոլ	° կալ/(մոլ Կ)	° 37 կկալ/մոլ
AA/TT	-7.6	-21.3	-1.00
AT/TA	-7.2	-20.4	-0.88
TA/AT	-7.2	-20.3	-0.58
CA/GT	-8.5	-22.7	-1.45
GT/CA	-8.4	-22.4	-1.44
CT / GA	-7.8	-21.0	-1.28
ԳԱ/ԿՏ	-8.2	-22.2	-1.30
CG/GC	-10.6	-27.2	-2.17
GC/CG	-9.8	-24.4	-2.24
GG/CC	-8.0	-19.9	-1.84
ընդունելը	+0.2	-5.7	+1.96
տերմինալ A-T զույգ	+2.2	+6.9	+0.05
համաչափության ուղղում	0.0	-1.4	+0.43

Միակ սխալ դուպլեքսի ներսում

Կոմպլեմենտար նուկլեոտիդային զույգերի մոտակա հարևան մոդելը կարող է տարածվել այն զույգերի վրա, որոնք ներառում են ոչ կոմպլեմենտար նուկլեոտիդներ։ Ցույց է տրվել, որ նվազման կարգով ոչ կոմպլեմենտար հիմքերի զույգերի կայունության նվազման միտում կա.

G-C > Ա-Թ> G G > G T ≥ G A > T T ≥ A A > T C ≥ A C ≥ C C

Գուանիդին G-ն ամենա«անառակ» հիմքն է, քանի որ այն ձևավորում է ամուր հիմքերի զույգեր ոչ կոմպլեմենտար հիմքերով (G·G, G·T և G·A): Մյուս կողմից, ցիտոսին C-ն ամենախտրական հիմքն է, քանի որ այն կազմում է առավել կայուն կոմպլեմենտար զույգերը և անկայուն զույգերը ոչ կոմպլեմենտար հիմքերով (T·C ≥ A·C ≥ C·C), .